[发明专利]一种荷叶铁线蕨离体再生体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种荷叶铁线蕨离体再生体系的建立方法，涉及荷叶铁线蕨（Adiantum reniforme var.sinense）通过植物组织培养技术以GGB途径再生的方法。本发明以荷叶铁线蕨的成熟孢子为外植体，经过外植体消毒、孢子萌发培养、增殖与分化等步骤建立了荷叶铁线蕨离体再生体系，对瀕危植物保护和缓解商业化生产需求具有重要意义。

主权项

一种荷叶铁线蕨离体再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：（1）外植体采取及处理：选择孢子囊群盖变为褐色、孢子囊群没有开裂的孢子叶剪下,置于干燥纸袋中,自然晾干,5～7天后孢子囊自然开裂,孢子散落于纸袋中,清除袋内杂质,收集干燥的孢子置于离心管中,并将装有孢子的离心管置于冰箱2～4℃保存备用;（2）孢子的消毒：选取经步骤（1）处理后的孢子置于1.5mL离心管中，在离心管中加入1～2滴吐温和适量蒸馏水,盖上离心管盖,稍稍摇晃后平放静置3～8min，然后将孢子在混合液中震荡均匀后转移到快速滤纸上,通过漏斗将过滤的废水用锥形瓶接住并迅速将该过滤装置置于超净工作台中，先用无菌水冲洗3～5次后用70%～80%乙醇浸泡10～40s，用无菌水清洗3～5次后用0.1%升汞溶液消毒1～10min，再用无菌水清洗3～5次后备用;（3）孢子萌发培养：将经步骤（2）处理后的孢子配置成浓度为0.3～1.0mg/mL的孢子悬浊液接种于萌发培养基上进行孢子萌发培养,接种后置于每天光照12～15小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至孢子萌发，所述的萌发培养基为：MS+0.5～1.0mg/L 6‑BA+1～3mg/L 2,4‑D+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂，pH值为5.4～5.8；（4）增殖培养：将步骤（3）的孢子萌发开始，生长80～100天后的原叶体切割成5mm×5mm大小并接种到增殖培养基上进行原叶体的增殖培养,接种后置于每天光照12～16小时，光照强度为2000～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，约60天继代一次，所述的增殖培养基为：MS+0.1～0.5mg/L 6‑BA+0.5～1mg/L 2,4‑D+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂，pH值为5.4～5.8；（5）GGB的诱导：将步骤（4）增殖的带有走茎的细嫩孢子体接种到诱导培养基上进行GGB诱导培养,接种后置于每天光照12～16小时，光照强度为2000～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，接种后每两周更换一次培养基，所述的GGB诱导培养基为：MS+0.01～0.5mg/L 6‑BA+1～3mg/L NAA+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂，pH值为5.4～5.8；（6）GGB分化培养：将步骤（5）诱导得到的GGB转接到分化培养基中进行GGB分化培养,接种后置于每天光照12～16小时，光照强度为2000～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养,接种后每两周更换一次培养基，所述的GGB分化培养基为：MS+0.1～1.0mg/L ZT+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂，pH值为5.4～5.8。