[发明专利]一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法

摘要

一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，包括材料选择、菌液制备、外植体浸染、共培养、阳性筛选、瞬时表达检测6个步骤。采用本发明能够将团花遗传转化瞬时表达效率提高863.6～908.9％，有效解决通过农杆菌介导方法浸染效率低、较难获得团花转基因植株的问题，有效降低农杆菌斑的生长，延长农杆菌与外植体共培养的时间而基本不伤害外植体，提高转基因的瞬时表达率。

主权项

一种提高团花遗传转化瞬时表达效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)材料选择选择20～25d的无菌团花幼苗,切取胚轴和带柄子叶为外植体；选择带GUS基因的植物表达载体pBI121，通过CaCl₂法导入农杆菌C58或LBA4404，获得菌液C或菌液L，菌液C为带植物表达载体pBI121的农杆菌C58菌液，菌液L为带植物表达载体pBI121的农杆菌LBA4404菌液；(2)菌液制备吸取50μL的菌液C或菌液L，转移到质量体积浓度比为50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和25mg/L链霉素的100mL YEB液体培养基中，于22℃、130r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀值为0.8，然后于5000r/min离心10min收集菌体，再用200mL DCR液体培养基重悬，于28℃、130r/min振荡培养，至菌液OD₆₀₀值为0.8～1.0，此时带菌液C或菌液L的DCR液体即为遗传转化浸染液；所述YEB培养基成分为：5.0g/L牛肉浸膏，1.0g/L酵母粉，5.0g/L蛋白胨，5.0g/L蔗糖，0.04g/L MgSO₄·7H₂O，pH值为7.0；所述DCR培养基成分为：P.K.Gupta和D.J.Durzan于1985年公开发表的DCR配方；(3)外植体浸染将切取的外植体浸入到装有步骤(2)遗传转化浸染液的三角瓶中，轻轻摇动让外植体完全浸泡在浸染液中，密封好三角瓶口，在0.05Mpa的真空干燥器内放置5min；(4)外植体共培养将步骤(3)中浸染后的外植体从遗传转化浸染液中取出，吸干外植体表面的农杆菌，然后转移到含液体分化诱导培养基的湿润滤纸上共培养；在22℃的黑暗条件下共培养6d；所述液体分化诱导培养基为DCR+2.0mg/L TDZ+0.05mg/L NAA+20g/L蔗糖，pH 5.2～5.4；(5)阳性筛选将共培养后的外植体转移到质量体积浓度比为12mg/L卡那霉素和100mg/L头孢霉素的固体分化诱导培养基中培养，在25±2℃、光周期为10h/d的条件下培养7d；所述固体分化诱导培养基为DCR+2.0mg/L TDZ+0.05mg/L NAA+20g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH5.8～6.2；(6)瞬时表达检测用灭菌的超纯水，将共培养7d后的外植体表面清净干净，浸没于GUS染色液中，于37℃的恒温箱中温育12h，然后转入体积浓度比为70％的乙醇溶液中脱色2～3次，每次10min，最后保存于体积浓度比为70％的乙醇溶液中；所述GUS染色液成分为：每1000mL溶液含15.601g NaH₂PO4，3.7224g Na₂EDTA,211.2mg K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O,164.7mg K₃[Fe(CN)₆],1mL Triton·X‑100,0.5g X‑Gluc；染色液的pH 7.0。