[发明专利]利用人工合成MV1序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法

摘要

一种利用人工合成MV1序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV1序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育和抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。本发明获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。本发明已获得的转基因植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。

主权项

一种利用人工合成MV1序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV1序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于：(1)MV1序列的人工合成：从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV1序列，同时在正义链5′端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5′端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：GATCTAGACT CGAGGACCCA AAAATTGTGG ATTTGCCACA GCATGTTATG CATTATCAGTATGGAAAAAA GTTACGTCGA TCTCTTAAAC CAAGCATGGG GCGTAGATTT AGGCGCAATGTACAATATCT CAGCTACGCA TCAAATATCA AATTTAGTGC AGAAAAGTCG AGATATTTCAACCAAACTCC ACCACAGTTT ATGTAAGAGA TAACAATAAG ATCAACAAGA GGATTACTCCTATAGCAACA CCAGATGGAT CCGTCACTTT AGTGATGCAG CTGAAGCGTA ATGCCAAGATACGGACTTCA GCGAAACTTG AGGCCCACAT GCAGATGAAA GCTGGAAAAT TTTCAGCAATATGGCGTGTG TTCATCTTTA ACCGTGAGAA AAAGCGTAGA TTTAGGCGCT GTTTACAATATATCAGCTAC GCATCTAATA TCAGATTTAG TGCAGAAGTC AGCTCTACTT TAACCAAACTCCGCAACGGT TTCTACAGGA GAATACAGAG AGACACACAG CTGGCGACGT AGTCGCAACATGCACTCTCT GTTGGGAGTG CAGCAGCACC ACTAGGGTAC CATCGATAG；(2)RNAi干扰载体构建：(a)目的片段Ⅰ的获得：利用限制性内切酶Kpn I和Xho I将目的片段A进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅰ；所述目的片段Ⅰ的序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(b)目的片段Ⅱ的获得：将pHANNIBAL载体质粒DNA用限制性内切酶Kpn I和Xho I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅱ，所述目的片段Ⅱ的序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；(c)中间载体B的获得：将回收的目的片段Ⅰ和目的片段Ⅱ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体B；所述中间载体B是指将目的片段Ⅰ插入到pHANNIBAL载体后获得的载体；(d)目的片段Ⅲ的获得：提取中间载体B的质粒DNA，并用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅲ；所述目的片段Ⅲ的序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；(e)目的片段Ⅳ的获得：将目的片段A用限制性内切酶Cla I和Xba I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅳ；所述目的片段Ⅳ的序列为序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；(f)中间载体C的获得：将回收的目的片段Ⅲ和目的片段Ⅳ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得中间载体C；所述中间载体C是指将目的片段Ⅳ插入到中间载体B后获得的载体；(g)目的片段Ⅴ的获得：提取中间载体C的质粒DNA，并用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅴ；所述目的片段Ⅴ的序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；(h)目的片段Ⅵ的获得：将植物表达载体pGreenII0229质粒DNA用限制性内切酶Not I进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目的片段Ⅵ；所述目的片段Ⅵ的序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；(i)抗甘蔗花叶RNAi干扰载体pG0229i‑MV1的获得：将回收的目的片段Ⅴ和目的片段Ⅵ用T4‑DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得可用于遗传转化甘蔗受体材料的RNAi干扰载体pG0229i‑MV1；(3)抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229i‑MV1质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μl，基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。