[发明专利]一种月季黑斑病菌的保存方法

摘要

一种月季黑斑病菌的保存方法。该方法包括月季黑斑病菌的分离、纯化培养、活力性检测、繁殖、保存及复活。其繁殖和保存是将培养并检测孢子活力性检测值大于或等于90％时后，调至1×10⁵-2×10⁶个/ml的孢子接种到经消毒处理的对月季黑斑病敏感的月季品种或野生种的离体叶片上，再在保湿的培养皿中，室内光强1800-3200lx、光周期为10-16h光期、8-14h暗期，空气相对湿度90-100％，室温18-28℃条件下培养7-14d。再取出离体叶片于液氮中速冻后，-70℃～-80℃冰箱保存。本发明使月季黑斑病菌的保存期延长至3年后，病菌活力仍达90％以上，病菌致病力达100％。

主权项

一种月季黑斑病菌的保存方法，其特征在于包括以下步骤：(1)月季黑斑病菌的分离和纯化培养①将感染了黑斑病菌的月季叶片放入体积分数为70％乙醇溶液20s，再用无菌蒸馏水清洗2‑3次，展开叶片将其平铺在盛有质量分数为1％琼脂的培养皿中，在室内光照强度为1800‑3200lx，光周期为10‑16h光期、8‑14h暗期，空气相对湿度90‑100％，室温18‑28℃的条件下培养24‑48h；②在解剖镜下用已灭菌的挑针从培养皿中分离出单个的萌芽真菌孢子，将其转移到盛有营养培养基的培养皿中，在室内黑暗条件下，且空气相对湿度90‑100％，室温为18‑28℃培养4‑5周，所述的营养培养基由以下重量份的成分混合而成：麦芽3.5份、酵母2份和琼脂2份；(2)月季黑斑病菌的活力性检测用无菌蒸馏水将步骤(1)②培养皿中的营养培养基洗掉，保留培养皿中的真菌菌落并转移到离心管中，在3000‑5000转/分的条件下离心10‑15min，将上清液转移到已灭菌的容器内，每次取出上清液1ml，用质量分数为0.07％的酚藏花红溶液进行真菌孢子的活力性检测，有活力的孢子不变色，失去活力的孢子变红，当孢子活力性检测值小于90％时，说明孢子活性不够，继续维持步骤(1)②所述培养至检测出孢子活力性检测值大于或等于90％，当孢子活力性检测值大于或等于90％时，将容器内上清液中的孢子浓度用无菌水调至1×10⁵‑2×10⁶个/ml用于接种备用；(3)月季黑斑病菌的繁殖和保存①繁殖：用喷雾法或滴液法将步骤(2)检测得到的孢子活力性检测值大于或等于90％，且该孢子溶液浓度调至1×10⁵‑2×10⁶个/ml的孢子接种到经消毒处理的对月季黑斑病敏感的月季品种的离体叶片上或接种到经消毒处理的对月季黑斑病敏感的月季野生种的离体叶片上，将接种后的离体叶片平铺于保湿的培养皿中，在室内光强1800‑3200lx、光周期为10‑16h光期、8‑14h暗期，空气相对湿度90‑100％，室温18‑28℃的条件下培养7‑14d；所述保湿的培养皿为将已灭菌的棉花平铺于培养皿中，在棉花上滴加10ml的无菌水；②保存：取出步骤(3)①培养皿中的离体叶片，用无菌滤纸吸干该叶片表面的水分后装入容器中，立刻将该容器放入液氮中速冻5‑15min后，取出再放入‑70℃～‑80℃的超低温冰箱保存；(4)月季黑斑病菌的复活从超低温冰箱中取出容器立刻放入4℃的环境中，待解冻后，将容器内的离体叶片平铺于保湿的培养皿中，在室内光强1800‑3200lx、光周期为10‑16h光期、8‑14h暗期，空气相对湿度90‑100％、室温18‑28℃的条件下培养以备用；所述保湿的培养皿与步骤(3)①所述的保湿的培养皿的保湿方式相同。