[发明专利]基于“Y”结点探针的双通道传感器检测急早粒PML/RARα基因序列的方法

摘要

本发明提供了一种基于“Y”结点探针的双通道传感器检测急早粒PML/RARα基因序列的方法。待检测基因为急性早幼粒细胞白血病的PML/RARα融合基因的dsDNA片段，包括如下步骤：根据所选择的待检测APL基因型别通用引物序列的融合位点，对APL的特异性序列进行设计及合成两组特异性的“Y”结点探针；采用“Y”结点探针、内切酶特异性剪切作用与电化学酶联放大技术实现同时检测 APL的PML/RARα融合基因双链 DNA 中的两条互补链。采集两组探针与靶标dsDNA中相对应的互补ssDNA链杂交后催化产生的电流信号并进行计算处理，可定量检测靶标dsDNA。该法实现了对急性早幼粒细胞白血病的早期诊断，同时也有望应用于其它疾病相关基因dsDNA的检测。

主权项

一种基于“Y”结点探针的双通道电化学传感器，包含有两组检测探针，其特征在于1）所述两组检测探针采用两组“Y”结点检测探针，其中一组是捕获探针（1）和辅助探针（1‑1），另一组是捕获探针（2）和辅助探针（2‑1），所述一组捕获探针（1）的 基因（C1）采用3’ 修饰生物素， 5’ 端巯基标记：5’‑SH‑ TTTT TTT TTT GGG TCT CAA TGG TGT ACA G‑ biotin ‑ 3’； 一组辅助探针（1‑1）的基因（A1）采用：5’‑CTG TAC ACT GCC TCC CC‑ 3’； 另一组捕获探针（2）的基因（C2）采用，3’ 修饰生物素，5’ 端巯基标记：5’‑SH‑ TTTT TTT TTT GGG AGG CAG AAG TAC TA‑ biotin ‑ 3’； 另一组辅助探针（2‑1）的基因（A2）采用：5’‑ TAG TAC TTC CAT TGA GAC CC‑ 3’；将两个捕获探针的基因（C1）和（C2）通过其修饰有的巯基分别自组装固定在不同通道上的两个型号相同的金电极表面，对两个金电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭；2）将上述两个辅助探针的基因（A1 ）和（A2） 提前混于含有靶标 dsDNA 的杂交溶液中，通过高温变性使靶标双链 DNA 解链成单链，并将变性后的杂交溶液置于冰浴中保持杂交溶液中 DNA 单链状态，同时加入一定量的限制性内切酶Rsa I；3）将分别修饰了两个捕获探针的基因（C1）和（C2）的两个金电极工作电极放入上述的含有限制性内切酶Rsa I和两个辅助探针的基因（A1 ）和（A2）的靶标 dsDNA待测杂交溶液中进行杂交反应；上述的两个辅助探针的基因（A1）和（A2）分别与靶标dsDNA 中相应的 DNA片段S1a 和DNA片段 S1b 形成两个稳定杂交体，有效阻止了靶标 DNA 的自身复性，同时这两个稳定杂交体（A1/S1a）和（A2/S1b）中各自杂交有的辅助探针的基因（A1）和（A2）与靶标 DNA 其余未杂交的序列又可与固定在金电极表面上的相应的捕获探针杂交，在每个工作电极表面分别形成特殊的“Y”结点构型，在“Y”结点构型中金电极表面上的捕获探针作为“Y的下部支撑杆”，两个稳定杂交体（A1/S1a）和（A2/S1b）分别与不同捕获探针相应的互补部分进行杂交后，其中含有的辅助探针的基因（A1）和（A2）的杂交体部分作为“Y的两分叉”），此时限制性内切酶 Rsa I 能够识别捕获探针的基因与辅助探针的基因（C1/A1）和（C2/A2）所形成的双链结构中特定的酶切位点，对其进行剪切，使得捕获探针修饰的生物素游离了出来，同时也破坏了“Y”结点构型的稳定性，DNA片段S1a 和 DNA片段S1b 被释放到杂交溶液中，开始新一轮的杂交过程，随着“杂交‑剪切‑释放”过程不断循环，经过一定时间后，金电极表面上存在的生物素越来越少； 4）在杂交溶液中加入亲和素修饰的辣根过氧化物酶，通过辣根过氧化物酶 (HRP) 上的亲和素(avidin)，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将辣根过氧化物酶结合到金电极上去，所述的金电极置于由 3，3’，5，5’‑ 四甲基联苯胺（TMB）和 H2O2 组成的检测底液中，通过辣根过氧化物酶  HRP 催化使得 H2O2 氧化 TMB 产生电化学信号，利用电化学双通道工作站同时采集电信号。