[发明专利]基于双重扩增策略构建的免标记荧光适体传感器检测腺苷

摘要

本发明公开了一种基于双重扩增策略构建的免标记荧光适体传感器检测腺苷，包括以下步骤（1）链霉亲和素化磁球‑探针的制备；（2）Exo III辅助的DNA循环和HCR反应；（3）荧光测量HCR反应完成后，向反应产物中加入NMM和KCl，孵育后进行荧光测量，得荧光值；(4)计算根据上述所测得的荧光值利用下述线性方程计算含有腺苷的待检测物中腺苷的浓度。本发明中的两种信号扩增策略的结合为体液中低腺苷水平的检测提供了较高的灵敏度；该方法还能显著的区分癌症病人和正常人尿液中腺苷的含量，表明该方法能够为医学研究和早期临床诊断提供一种新的可靠的用于腺苷定量的策略。

主权项

一种基于双重扩增策略构建的免标记荧光适体传感器，其特征是：包含催化链、适体链和链霉亲和素化磁球三功能探针；其中，所述催化链为：5’‑ACT GCA TCG CAA TAC TCG ATT TTT T‑3’；所述适体链为：5’‑biotin‑TTT TTT TTT ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GTT‑3’；具体应用为，所述的基于双重扩增策略构建的免标记荧光适体传感器检测腺苷的方法，所述方法用于非治疗和非诊断的目的，具体步骤如下：(1)链霉亲和素化磁球‑探针的制备：首先，用TTL缓冲液对链霉亲和素化的磁球洗涤，得活化后的链霉亲和素化的磁球；其中，所述TTL缓冲液的组成为：由Tris‑HCl、Tween20、LiCl和水组成，其中，各组分的浓度为：0.1mol L‑1Tris‑HCl，pH 8.0，体积分数为0.1％的Tween‑20，1.0mol L‑1LiCl；然后，将分装好的适体链和催化链进行退火，退火后冷却至室温；随后将两者混合并与活化后的链霉亲和素化磁球混合在室温下孵育；最后，孵育后的链霉亲和素化磁球用PBS缓冲液洗涤，制得链霉亲和素化磁球‑探针；(2)Exo III辅助的DNA循环和HCR反应：首先，将含有腺苷的待检测物与TNaK缓冲液加入到试管中，在室温下孵育；随后，在磁场作用下分离出链霉亲和素化磁球，并保留反应液至新离心管中；其中，所述TNaK缓冲液的组成为：Tris、NaCl、KCl和水组成，其中各组分的浓度为：20mmol L‑1Tris，600mmol L‑1NaCl，5mmol L‑1KCl，pH 7.5；添加量为15μL；然后，分别取探针HP，Exo III和10×Exo III缓冲液加入到离心管中；混匀后进行Exo III辅助DNA循环反应；水解完成之后，加热以终止酶的活性；其中，所述探针HP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；最后，加入发卡探针H1和探针H2，混匀进行HCR反应；其中，所述发卡探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；(3)荧光测量HCR反应完成后，向反应产物中加入N‑甲基卟啉二丙酸IX和KCl，孵育后进行荧光测量，得荧光值；(4)计算：根据上述所测得的荧光值利用下述线性方程计算含有腺苷的待检测物中腺苷的浓度；线性方程为：ΔF＝15.12+143.58×105C，r＝0.998；其中，ΔF表示荧光净信号值，C表示腺苷的浓度，单位为mol L‑1；该线性方程的线性范围是1.0×10‑6mol L‑1～1.0×10‑4mol L‑1之间。