[发明专利]一种高产乙醇的酿酒酵母及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种高产乙醇的酿酒酵母及其构建方法和应用。选定ADH2基因中的某段序列作为靶标序列，再确定靶标序列上下游的靶标识别域碱基序列，根据上下游的靶标识别域碱基序列设计TAL重复单元，再分别连接至左臂载体Ptalen L48和右臂载体Ptalen R36上，分别得到靶标ADH2基因的TALEN左臂载体ADH2 Ptalen L48和右臂载体ADH2Ptalen R36，用限制性内切酶HindIII和AscI双酶切靶标ADH2基因的TALEN左臂载体ADH2Ptalen L48，用限制性内切酶AscI和SacI双酶切靶标ADH2基因的右臂载体ADH2 Ptalen R36，用HindIII和SacI限制性内切酶双酶切带潮霉素抗性标记的亚克隆载体p1301M1，分别回收大片段，将三个酶切过的大片段进行连接，得到重组质粒p1301M1‑ADH2 TALEN，再将其电转化至酿酒酵母感受态细胞中，筛选阳性克隆，得到高产乙醇的酿酒酵母。

主权项

1.一种高产乙醇的酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：选定ADH2基因中的某段序列作为靶标序列，再确定靶标序列上下游的靶标识别域碱基序列，根据上下游的靶标识别域碱基序列设计TAL重复单元，再分别连接至左臂载体Ptalen L48和右臂载体Ptalen R36上，分别得到靶标ADH2基因的TALEN左臂载体ADH2 Ptalen L48和右臂载体ADH2 Ptalen R36，用限制性内切酶HindIII和AscI双酶切靶标ADH2基因的TALEN左臂载体ADH2 Ptalen L48，用限制性内切酶AscI和SacI双酶切靶标ADH2基因的右臂载体ADH2 Ptalen R36，用HindIII和SacI限制性内切酶双酶切带潮霉素抗性标记的亚克隆载体p1301M1，分别回收大片段，将三个酶切过的大片段进行连接，得到重组质粒p1301M1‑ADH2 TALEN，再将重组质粒p1301M1‑ADH2 TALEN电转化至酿酒酵母感受态细胞中，筛选阳性克隆，得到ADH2基因被敲除的重组酿酒酵母△ADH2As2.4，即为高产乙醇的酿酒酵母；所述的靶标序列为5’‑TCAACCTCGTATTCCTA‑3’；所述的酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)As 2.4。