[发明专利]转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法及鉴定方法

摘要

转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法及鉴定方法，属于培育酵母新菌株的方法。本发明包括提取和纯化葡萄汁酵母DNA构建SSU1基因表达载体；葡萄汁酵母转基因；葡萄汁酵母菌株耐硫性测定；PCR筛选转化子；PCR产物测序灭菌后的含硫葡萄汁发酵试验等。测序表明候选转化子中均含有转基因特征序列。试验表明转化子ACY330‑SSU1和A4‑SSU1均能在含15 mg/L亚硫酸钠的基质中很好的发酵。本发明获得了葡萄汁酵母耐硫转基因后代菌株，转化子菌株鉴定的准确率极高。

主权项

转SSU1基因提升葡萄汁酵母耐硫能力的方法，包括以下步骤：（1）在YPD培养基中培养葡萄汁酵母以扩增细胞，收集该细胞于离心管后破碎，释放内含物，收集DNA；所述YPD培养基是含10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、 20 g/L琼脂、20g/L葡萄糖的固体培养基；（2）构建葡萄汁酵母SSU1基因表达载体：以耐硫菌株A9的DNA为模板，扩增SSU1基因，引物为L1: GCA GGA TCC GCT TAT TTT GCT CAA TTT TCT T；R1: CAG GTC GAC AAG CCA GTG TTA GCC CAA TC；用Bam H I和Sal I对PCR产物进行酶切，引物下划线部分为Bam H I的酶切位点和Sal I的酶切位点，其产物与同样经Bam H I和Sal I双酶切的表达载体YEp352连接，构建重组质粒，再将重组质粒电击转化至大肠杆菌DH5α中成为转化子1；进一步，随机挑选步骤（2）的大肠杆菌DH5α转化子进行PCR分析，测序验证转化子1；（3）目的基因转化葡萄汁酵母：制备葡萄汁酵母感受态细胞；在LB培养基中扩大培养转化子1，提取重组质粒；将葡萄汁酵母感受态细胞与重组质粒按体积比（8～10）：1混匀于电击杯中电击，室温静置后加入少量YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h，构建成为目的基因转化葡萄汁酵母的转化子2；所述LB培养基是含胰化蛋白胨 10g/L 酵母提取物 5g/L NaCl 10g/L的液体培养基；YEP培养基是含10g/L牛肉浸膏、10g/L酵母粉、5g/L NaCl，PH为7.0的液体培养基；（4）培养葡萄汁酵母耐硫菌株：将步骤（3）的转化子2和葡萄汁酵母菌株接种于新鲜的含15mg/L亚硫酸钠的YPD培养基上培养葡萄汁酵母耐硫菌株，该YPD培养基的pH3.5，且含80mM琥珀酸盐。