[发明专利]一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法

摘要

本发明提供了一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法，包括烟腈水合酶生产菌细胞的培养、固定化细胞的制备、固定化细胞生物转化烟腈生产烟酰胺化水合反应、烟酰胺的提取工艺。本发明方法中采用固定化细胞作为催化剂，可以使生物催化剂多次重复利用，降低了生产成本，简化了工艺，产物产率有着很大的提高。本方法工艺简单，适合大规模生产，产物转化率高，纯度高。

主权项

一种利用固定化细胞将烟腈转化为烟酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、烟腈水合酶生产菌细胞的培养： a、 取葡萄糖40‑60g，琼脂20‑30 g，牛肉膏50‑60 g， MgS0₄ 0.6‑1g，NaCl 10‑15 g，KH₂PO₄ 0.7‑1 g，K₂HPO₄ 0.8‑1.5g，溶于适量水中，定容至1000mL，然后调pH至6.8‑7.2，作为细菌的生长培养基；将枯草芽孢杆菌放在紫外灯的条件下培养48小时，得到枯草芽孢杆菌的突变株体作为菌种，将培养基灭菌后接入培养基体积的1‑5%的菌种，于摇床上以60‑200rpm恒温振荡培养，培养温度25‑31 ℃，培养时间24‑72h，得到种子液；然后进行发酵培养：发酵培养基消毒后接入培养基体积的2‑5%的种子液，发酵前中期发酵罐的通气量为1:0.7‑0.9V／V·min，后期的通气量为为1：0.3‑0.4V／V·min，发酵温度为25‑35 ℃，以70‑150rpm的速度搅拌发酵40‑80h，得到发酵液，发酵罐发酵时，让罐压先慢慢上升，然后再缓慢下降；要求罐压在24小时之内控制在0.04‑0.05MPa下，以后罐压的变化为24‑48小时控制在0.045‑0.055MPa下，48‑72小时控制在0.035‑0.045MPa下，72小时之后控制在0.025‑0.035MPa的压力下； b 、将发酵液进行离心处理，去除上清液，得到湿的产腈水合酶细胞，加入湿的产腈水合酶细胞质量的1‑2%的羧甲基纤维素钠，适量的去离子水，充分搅拌形成浓度为20‑25%的产腈水合酶细胞悬浊液，再将此悬浊液注射到到浓度为3‑5 % 的CaCl₂水溶液中，注射结束以后低温保存，得固定化细胞悬浊液，即烟腈水合酶生产菌细胞悬浊液；  （2）、烟腈水合酶催化水合反应   在反应釜中，先添加容器量的50‑60%的去离子水，调pH到7.0，采用分批加料的方式先向反应釜中首次添加底物 3‑氰基吡啶和上述获得的生物催化剂固定化细胞悬浊液，在18‑22℃，50‑200rpm的搅拌速度下进行生物催化转化反应，每隔1小时对反应液中的3‑氰基吡啶浓度进行检测，当浓度低于0.5g/L时，开始补加底物和生物催化剂固定化细胞悬浊液，补加的量与起始量一致，底物烟腈反应一定时间后，用HPLC法测定转化液中烟腈残留量,当烟腈残留量接近零时，即为生物催化反应的终点，所述的底物3‑氰基吡啶和生物催化剂固定化细胞悬浊液的每批添加质量比为5:1；（3）、烟酰胺的提取纯化工艺：a、当转化液中烟酰胺的浓度在室温下达55‑58 %， 开始冷却析晶,在结晶过程中开启搅拌，且当温度降到10‑11 ℃时加入适量晶种，促使晶核形成并缓慢生长，所得烟酰胺晶体大，色泽好，过滤出晶体，得到一次母液，一次母液直接冷却析出烟酰胺晶体，滤出晶体，得到二次母液；b、所得二次母液中烟酰胺浓度为25‑28%， 先真空蒸发出一部分水分，使得溶液达到饱和状态再进行下一步的冷却析晶，所得三次母液在大生产时可套用至下一批转化液中，合并多次结晶的晶体，即为成品。