[发明专利]一种分离纯化苹果轮纹病菌的简易方法

摘要

本发明公开了一种分离纯化苹果轮纹病菌的简易方法，涉及植物病原菌的分离与纯化技术。从采集的轮纹病枝上，切取新鲜的轮纹病斑或病键交界处的寄主组织，在灭菌的马铃薯葡萄糖培养液中侵泡5~20分钟后，直接接种30~80日龄苹果幼果的人制伤口，在20~30℃环境下保湿培养5~7天；待接种果实发病并形成0.2~1cm宽的环状病斑后，转入黑光灯或紫外灯下培养5~10天，诱导病斑产生分生孢子；将孢子涂布到2%琼脂平板上，在显微镜下挑取单个的分生孢子，转入PDA培养基中培养，可获得苹果轮纹病菌的单孢分离菌株。本发明以克服了常规方法分离纯化方法工作量大、诱导产孢困难、分离频率低等问题，为轮纹病的研究提供了一套简便、快捷、准确、可靠的病原菌分离纯化技术。

主权项

一种分离纯化苹果轮纹病菌的简易方法；其特征在于：在苹果幼龄果实的伤口内直接接种轮纹病的病组织，保湿培养，待果实发病并形成病斑后，诱导病斑产生分生孢子，挑取单个的分生孢子培养，获得轮纹病菌的单孢菌株；所述苹果幼龄果实为从果园内摘取的30~80日龄的苹果幼果，其中用50~60日龄的富士品种幼果诱导产孢效果最好；苹果幼果可以放在3℃~5℃的冷藏箱内长期保存；所述伤口是对苹果幼果进行表面消毒后，用打孔器或小刀，在果实表面均匀挖孔，人为制造伤口，伤口直径和深度不要超过5毫米，间距不小于2厘米；所述轮纹病的病组织是从果园内采集带有轮纹病斑的枝条和果实，用小刀切取病斑，或病健交界处的寄主组织，病组织大小不超过5毫米；所述接种是将轮纹病的病组织在灭菌的马铃薯葡萄糖培养液中浸泡5~20分钟后，直接塞入幼果的伤口中，每个伤口一块病组织；所述保湿培养是把接种幼果放入保湿缸或保湿盒内，转入20℃~25℃的环境中保湿培养5~7天，诱导接种果实发病；所述诱导病菌产生分生孢子是当发病幼果形成0.2~1cm宽的环状病斑后，将病果放在10W~60W，波长约为365nm黑光灯，或波长约为256nm紫外灯下培养5~10天；病果离灯的距离不超过20厘米，环境温度控制在20℃~30℃之间，相对湿度控制在60%~90%之间，诱导病斑上的轮纹病菌产生分生孢子；其中黑光灯诱导果实产孢的效果更好； 所述挑取单个的分生孢子培养是用玻璃毛细管挑取分生孢子角，涂布到2%水琼脂平板上，在100倍显微境下，找单个的分生孢子，用烧制的毛细管或挑针挑出，转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上培养。