[发明专利]一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法

摘要

本发明涉及一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法；针对现有常用的PMSCs分离方法中存在的问题与缺陷，其解决问题的技术方案包括以下步骤：一：用大镊子取出胎盘将胎盘切割；二：剥离胎盘母体面和婴儿面；三：胎盘绒毛消化；四：用1000mlPBS稀释消化液，过滤离心收集细胞备用；五：用PBS重悬细胞，离心沉淀细胞；六：细胞传代培养；七：细胞冻存，本发明中用胶原酶I一步消化法分离PMSCs，能够减少操作步骤，减轻细胞损伤，有效提高目的细胞所占的比例，减少其他细胞的污染；从而缩短了细胞原代培养时间并使细胞纯度得到提高，能够大幅降低成本并能很好维持PMSCs原始状态，为PMSCs的大量制备以及将来广阔的临床应用打下了坚实的基础。

主权项

一种人胎盘来源间充质干细胞的分离、培养方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：用大镊子取出胎盘，放入白瓷盘中，用生理盐水充分洗涤，用直剪刀将胎盘上残留的脐带剪掉，用手术刀将羊膜切除，将胎盘切割成四块，分装到15cm培养皿中；步骤二：用酒精棉球擦拭胎盘母体面和婴儿面，用直剪刀将母体面组织剪掉留婴儿面备用；步骤三：剥离出胎盘绒毛，用组织剪将之剪成1‑3mm³大小的组织块后放入50ml离心管中，加入二倍体积的0.1%胶原酶I，置于37℃培养箱中消化15h备用；步骤四：用1000mlPBS稀释步骤三消化液后200目滤网过滤，800g，15min离心收集细胞备用；步骤五：弃上清后用PBS重悬细胞，500g，5min离心沉淀细胞；步骤六：使用添加有5%组成为：3%‑6%结合蛋白；0.5%‑1.5%生长因子；0.5%‑1.5%（组氨酸：脯氨酸3：1）；0.03%‑0.07%固醇类激素；0.1%‑0.5%【（维生素B1：维生素B2：维生素B6：维生素B12 1：1：1：1）： 维生素C ：维生素D ：维生素E 1：1：1：1】；0.01%‑0.03%（铁：锌：钼：钴2：2：1：1）；0.5%‑1.5%粘附因子；87.4%‑95.36%去离子水的血清替代物MEM‑α培养基重悬细胞并接种于10cm细胞培养皿中，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱内进行培养，3‑4d后添加新鲜的含有5%血清替代物的MEM‑α培养基，待细胞达到80%融合时用0.05%胰酶消化，传代培养；步骤七：待细胞扩增至3‑6×107个时用0.05%胰酶消化，800g，15min离心收集细胞，用新鲜的含有5%血清替代物的MEM‑α培养基重悬，加入冻存保护剂并使用程序降温仪冻存细胞，程序为：以1℃/min的速率降至‑5℃后，以3℃/min的速率降至‑20℃，再以1℃/min的速率降至‑60℃，最后以5℃/min的速率降至‑120℃，结束后放入液氮中冻存。