[发明专利]一种烟草毛状根诱导和培养生产重组蛋白的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，特别是涉及植物毛状根瞬时表达重组蛋白的方法，更为具体的说是涉及一种烟草毛状根诱导和培养生产重组蛋白的方法。用生长迅速的单克隆烟草毛状根作为宿主，通过农杆菌介导病毒表达载体快速表达外源蛋白，并分泌到培养基中，从而建立了一种快速高效的毛状根通用表达系统用于重组蛋白的表达。

主权项

一种烟草毛状根诱导和培养生产重组蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下各步骤：（1）烟草花叶病毒瞬时表达载体的构建：以限制性核酸内切酶ＰａｃⅠ和ＮｏｔⅠ双酶切烟草花叶病毒瞬时表达载体ＰＪＬ　ＴＲＢＯ－ZB 和克隆载体ｐＥＡＳＹ－重组蛋白的质粒ＤＮＡ，产物经１．０％琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带并分别回收酶切片段；将回收的载体和基因片段按比例混合，用Ｔ４ＤＮＡ 连接酶于４ ℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，涂平板后培养过夜，随机挑取菌落进行扩大培养，小提质粒后用限制性内切酶ＰａｃⅠ和ＮｏｔⅠ进行酶切鉴定；（2）取含目的基因的质粒各5 ul分别与100 ul 农杆菌GV3101 感受态细胞均匀混合， 置于冰上1 min后；加入到灭菌的电击杯中进行电击转化，培养后，挑取单菌落进行菌液PCR 鉴定；（3）将菌液按体积比1：25转接入1M 培养基中，28 ℃振荡培养16~ 18 h，振荡培养至A 600约为1.0，离心收集农杆菌，10 mmol/ L MgCl2 ，10 mmol/L MES等体积重悬，再次离心收集菌体，10 mmo l/ L MgCl2 ，10 mmol/ L MES,200 mmo l/ L AS等体积重悬，室温静止2~ 3 h 后即可接种，将重组农杆菌悬浮浸润烟草毛状根，25℃摇床暗培养过夜，并置于MS+ 4 0 m g/L 头孢噻唑钠中除菌培养12h，转接1/2MS液体培养基，135rpm、25℃摇床暗培养5d，收集MS培养液；（4）通过无机陶瓷膜过滤，去除小分子杂质，将保留的目的蛋白粗品通过镍亲和柱进行蛋白纯化，纯化后进行SDS‑PAGE,纯度鉴定，能获得1MG以上，纯度大于90%的重组蛋白。