[发明专利]一种可确定抑菌蛋白质片段分子量的抑菌实验方法

摘要

一种可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，涉及微生物技术领域；制备试剂、分离胶和浓缩胶后，对进行抑菌实验的蛋白质进行蛋白质电泳，所得蛋白质电泳胶片进行脱色、染色，成像观察蛋白质分子量大小后，用于做抑菌实验；将蛋白质电泳胶片进行放入PBS缓冲液中平衡10min后，置于琼脂培养皿中；取处于对数生长期的菌液加入到50℃的营养琼脂培养基中，得到体积浓度为1%的菌液；取所得菌液倒入放有脱色后蛋白质电泳胶片的培养皿中,观察培养基中菌体生长情况，并确定抑菌效果好的蛋白质片段分子量的大小。本发明采用一种操作简单、准确、快速、廉价的方法来确定具有抑菌效果蛋白质片段分子量的大小，具有广阔的应用前景。 1

主权项

1.一种可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、试剂和缓冲液的配制：

1)、染色液：称取0.25g考马斯亮蓝R‑250置于容器中，加入225ml甲醇和46ml冰醋酸，搅拌至溶解后加超纯水定容至500ml，混合均匀，备用；

2）、脱色液：分别量取37.5ml冰醋酸和25ml甲醇置于容器中，加超纯水定容至500ml，混合均匀，备用；

3）、电极缓冲液：分别称取3.0g三羟甲基氨基甲烷、18.8g甘氨酸和1.0g十二烷基硫酸钠溶液置于容器中，加入超纯水搅拌溶解后，定容至1000ml，混合均匀，备用；

4）、上样缓冲液：分别称取1.0g十二烷基硫酸钠和0.02g溴酚蓝置于容器中，然后向容器中加入16ml甘油、1ml 的1.0mol/L pH6.8三羟甲基氨基甲烷‑盐酸和1ml的β‑巯基乙醇，混合均匀，加入超纯水搅拌溶解后定容至100ml，混合均匀，采用离心管分装，置于4℃保存；

5）、PBS缓冲液：分别称取8.0g NaCl、0.24g KH₂PO、0.2g KCl和3.36g

Na₂HPO₄.12H₂O置于容器中，加入900mL去离子水，搅拌至完全溶解后，调节pH至7.4，加入去离子水定容到1L，然后置于121℃高温灭菌20min，冷却至室温，备用；

6）、12%分离胶溶液：每10ml的12%分离胶溶液中含有30%丙烯酰胺混合溶液 4.0 ml，1.5mol/L的pH8.8三羟甲基氨基甲烷‑盐酸2.5 ml，质量分数为10%的十二万基硫酸钠溶液0.1 ml，质量分数为10%的过硫酸铵溶液0.1 ml，四甲基乙二胺0.004 ml、去离子水3.3 ml和尿素3g；其中，所述30%丙烯酰胺混合溶液的配制方法为，取丙烯酰胺30g和双丙烯酰胺0.8g置于容器中，然后加入100ml去离子水搅拌至完全溶解，即得到30%丙烯酰胺混合溶液；

7）、5 %浓缩胶溶液：每5ml的5 %浓缩胶溶液中含有30%丙烯酰胺混合溶液0.83 ml，1.5mol/L的pH8.8三羟甲基氨基甲烷‑盐酸0.63 ml，质量分数为10%的十二万基硫酸钠溶液0.05 ml，质量分数为10%的过硫酸铵溶液0.05 ml，四甲基乙二胺0.004 ml和去离子水3.4 ml；所述30%丙烯酰胺混合溶液的配制方法为，取丙烯酰胺30g和双丙烯酰胺0.8g置于容器中，然后加入100ml去离子水搅拌至完全溶解，即得到30%丙烯酰胺混合溶液；

步骤二、分别灌注12%分离胶溶液和5 %浓缩胶溶液制备12%分离胶和5%浓缩胶，备用；

步骤三、将粗蛋白质样品和蛋白质标准品分别与上样缓冲液按照体积比1:1的比例混合均匀后，均置于水浴锅中100℃水浴5分钟，自然冷却至室温，备用；

步骤四、上样：采用微量进样器将蛋白质样品与蛋白质标准品分别加入到浓缩胶上的加样孔内，加入量为20μL/孔；浓缩胶上的空加样孔应采用20μL的上样缓冲液灌注，以保证电流在胶中分布均匀；

步骤五、电泳：盖上电泳槽盖，连接电泳仪，接通电源，调节电压使蛋白质样品和蛋白质标准品在浓缩胶中时控制电压为80V，当蛋白质样品和蛋白质标准品进入分离胶后的电压为100V，电泳至溴酚蓝指示带接近分离胶底部1‑1.5cm时断开电源，停止电泳，取出蛋白质电泳胶片，备用；

步骤六、电泳结果检测：采用染色液对蛋白质电泳胶片进行染色后，用脱色液进行脱色，然后进行成像拍照；通过蛋白质样品与蛋白质标准品条带的对比得知样品蛋白质的分子量大小；将已经检测过的脱色后蛋白质电泳胶片保存，备用；

步骤七、脱色后蛋白质电泳胶片做抑菌实验：

1）、在已灭菌的培养皿中倒入10ml 灭菌的质量分数为2%的琼脂进行封底；所述质量分数为2%的琼脂，每100ml去离子水中含有2g琼脂；

2）、将脱色后蛋白质电泳胶片放入PBS缓冲液中平衡10min，然后置于倒入质量分数为2%的琼脂的培养皿中；

3）、取2ml处于对数生长期的菌液加入到50℃的200ml营养琼脂培养基中，轻轻摇匀后，得到体积浓度为1%的菌液；所述营养琼脂培养基含有质量分数为 1%的蛋白质胨、质量分数为 0.3%的牛肉膏粉、质量分数为 0.5%的NaCl和质量分数为 1.5%的琼脂，余量为水；

4）、取30ml体积浓度为1%的菌液倒入放有脱色后蛋白质电泳胶片的培养皿中；然后置于37℃培养12h，观察菌体生长情况，并确定抑菌效果好的蛋白质片段分子量的大小；

将所述采用染色液对蛋白质电泳胶片进行染色后，用脱色液进行脱色的具体操作方法为：将蛋白质电泳胶片置于培养皿中，加入染色液，染色2h后倒掉染色液，用蒸馏水清洗几次后，加入脱色液，在摇床上脱色12h，每4h更换一次脱色液，直至电泳条带清晰可见。

2.如权利要求1所述的可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：所述灌注12%分离胶溶液的方法为：用移液枪将配制好的12%分离胶溶液反复吹打5次，使分离胶溶液混合均匀；用移液枪将混匀后的分离胶溶液灌入到电泳槽内由高板和矮板组成的玻璃腔中，灌注高度为矮板高度的3/5，灌胶完成后，向玻璃腔中加满去离子水压平分离胶界面，待分离胶溶液凝结完全，即得到12%分离胶；倒去分离胶顶部的去离子水，并用滤纸吸干残余水分。

3.如权利要求1所述的可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：所述5 %浓缩胶的灌注方法为：用移液枪将配制好5 %浓缩胶溶液吹打5次，使浓缩胶溶液混合均匀；用移液枪将混匀后的浓缩胶溶液灌入到分离胶顶部，灌至距离矮板顶部0.5cm停止，然后将样品槽模板插入浓缩胶中，并保证样品槽模板底部无气泡产生，静置40min，待浓缩胶溶液完全凝结，拔出样品槽模板，形成加样孔；用去离子水加入到加样孔中倒出；然后调换玻璃腔使矮板向里，再用固定板将玻璃腔固定，即得到5 %浓缩胶；接着，向电泳槽内加入电极缓冲液。

4.如权利要求3所述的可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：所述样品槽模板为电泳梳。

5.如权利要求1所述的可确定抑菌蛋白片段分子量的抑菌实验方法，其特征在于：所述步骤六中，采用凝胶成像仪对蛋白质电泳胶片进行成像拍照。