[发明专利]表达和纯化同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体蛋白的方法

摘要

表达和纯化同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体蛋白的方法，属于生物技术领域，是一种同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体蛋白在E.coli体内的表达和纯化方法。本发明的方法包括同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白cDNA的获取、载体构建、蛋白诱导表达、GST‑α‑synδ3δ5纯化以及GST标签的去除步骤。本发明的方法实现了体外同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体的表达，为体外研究其聚集特性、细胞毒性、迁移特性以及同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体的动物模型建立奠定了基础，为深入探究其与帕金森氏症致病机制相关性研究提供了方法。

主权项

表达和纯化同时缺失外显子3和5 的α突触核蛋白选择性剪切体的方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤：第一步，设计合适的引物，引入酶切位点SmaⅠ和NotⅠ，通过两步PCR方法，从α突触核蛋白全长基因序列中克隆出缺失外显子3和5 的α突触核蛋白选择性剪切体基因，并通过DNA测序方法确定基因序列的准确性，α突触核蛋白全长基因为420bp，缺失外显子3和5的异构体基因序列全长297bp；第二步，通过SmaⅠ和NotⅠ限制性内切酶双酶切载体PGEX‑5X‑1和目的基因后，在T4连接酶作用下，将目的基因克隆入载体PGEX‑5X‑1中；第三步，双酶切方法初步筛选出阳性克隆子后进行DNA测序，确定目的基因正确插入载体多克隆位点；鉴定正确的克隆子命名为PGEX‑5X‑1‑α‑synδ3δ5；转化E.coli BL21菌株，进行IPGT诱导表达，分离上清和包涵体进行SDS‑PAGE电泳分析，相比较空载体转化组PGEX‑5X‑1，转化PGEX‑5X‑1‑α‑synδ3δ5的菌株在36KD左右处有一特异性条带，说明表达成功，表达成功后对诱导剂的终浓度、诱导温度以及诱导时间进行优化，得出表达的最佳条件为：IPTG终浓度为1Mm、温度37℃、时间3h，使重组融合蛋白GST‑α‑synδ3δ5得到高效外源表达；第四步，采用海狸GST融合蛋白纯化磁珠BeaverBeadsTMGSH，根据其对GST的特异性识别，从菌体总蛋白中纯化出融合蛋白GST‑α‑synδ3δ5；具体步骤如下：（1）收集的菌体加入15ml buffer A，所述buffer A为140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8M KH2PO4，pH 7.4；充分悬浮后，进行超声破碎，频率200HZ工作10s，间隙5s，超声上清液清澈为宜；分离上清；（2）取适量的GST融合蛋白磁珠与上清液蛋白混合，在低温环境进行漩涡震荡1h；（3）磁珠用bufferA清洗三次后，转移到新的干净的离心管中，加入buffer B，所述buffer B为50mM Tris‑HCl，10mM 谷胱甘肽， pH 8.0；低温漩涡震荡10Min，磁性分离，目标蛋白GST‑α‑synδ3δ5即被洗脱于buffer B中；并且重复操作四次，发现磁珠特异性好，重复使用效果稳定；第五步，采用10KD的milipore超滤管对融合蛋白进行浓缩，4500g浓缩30min，去除buffer B；稀释于酶切缓冲液中，所述酶切缓冲液为pH8.0，50mM Tris‑HCl，100mM NaCl，5mM CaCl2；BAC蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度后，按照每50μg目的蛋白切割需要Xa因子蛋白酶1μL的比例加入蛋白酶，16℃孵育过夜，切割GST标签释放目的蛋白；第六步，采用海狸GST融合蛋白纯化磁珠BeaverBeadsTMGSH去除GST标签蛋白，具体步骤为：采用3KD的milipore超滤管进行浓缩，去除酶切缓冲液，加入适当体积的buffer A 进行稀释；稀释后加入海狸GST融合蛋白纯化磁珠后，低温环境下漩涡震荡1h，去除体系中的GST标签，得到缺失外显子3和5的α突触核蛋白选择性剪切体重组蛋白；Western blot 通过特异性一抗anti‑alphy synuclein检测重组融合蛋白GST‑α‑synδ3δ5及同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白异构体蛋白活性，同时anti‑β‑actin 一抗做阳性对照，结果显示在36KD左右处及11KD左右出检测到了特异性条带，说明同时缺失外显子3和5的α突触核蛋白剪切体蛋白得到成功表达和纯化。