[发明专利]人类羊膜间充质细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞方法

摘要

本发明提出一种将人类羊膜间充质细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的方法，其步骤包括：原代细胞的分离培养；原代细胞的纯化；原代细胞流式细胞仪鉴定；2-巯基乙醇，B27，bFGF，烟酰胺诱导；诱导后细胞形态功能鉴定。本发明为体外将人类羊膜间充质细胞诱导分化形成胰岛素分泌细胞的方法，诱导人类羊膜间充质细胞分化为巢蛋白阳性细胞，诱导巢蛋白阳性细胞扩增并分化为前体细胞，诱导胰岛素分泌细胞成熟证实羊膜间充质细胞在特定环境下有向胰岛素分泌细胞转化的可能性，由于羊膜间充质细胞来源广泛，且无伦理学方面的障碍，这为临床干细胞移植提供了新的思路。

主权项

一种人类羊膜间充质细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞方法，其包括如下步骤：S1：原代细胞的分离培养:无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，将羊膜与绒毛层钝性分离，置于含有双抗的D‑HANKS液反复冲洗；将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约1*1mm碎块，加入2.5G/L胰蛋白酶37℃消化10min，加入含5％小牛血清的RPMI 1640培养基终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，过滤后的羊膜组织中加入1.0g/LⅡ型胶原酶消化液，37℃消化0.5h，再次用5％小牛血清的RPMI1640终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞，1000r/min离心5min，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞密度为1*106接种到25cm2培养瓶，加入含1％青链霉素，10ng/mlbFGF和10％FBS的RPMI1640培养基；置于37°c，饱和湿度，体积分数5％的CO2培养箱进行培养；倒置相差显微镜下每天观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液一次，并摄片记录，待细胞长满70％瓶底时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化细胞，消化过程中，用倒置显微镜观察细胞消化情况，待大部分细胞胞体回缩、变圆，立刻终止消化，以1:2比例传代培养，记为P1代，传代过程中，隔日换液一次，待细胞长满70％瓶底重复以上步骤，传代培养记为P2代，依次类推；S2：原代细胞免疫吸附法纯化：上述细胞培养5天后，用0.125％胰酶，37℃消化10min,1000rpm,离心6min收集，用PBS洗3次，接种在无血清RPMI1640培养基中，向细胞悬液内加入鼠抗人Thy1.1单克隆抗体，作用浓度为20ng/ml，37℃下作用30min，该抗体将与间充质来源的成纤维细胞特异性结合，细胞悬液离心除培养基，新鲜培养基洗2次除去抗体，全培养基重新悬浮细胞，移入山羊抗鼠IgG包被过的培养皿中，37℃下孵育1H，将细胞悬液再次吸出离心，培养基洗一次，加入全培养基后移入PLL包被的培养皿中，调节接种密度为10⁶/ml，第三天加入新鲜培养基1ml，第五天观察细胞生长情况，胰酶消化后重新接种在PLL包被过的培养皿中，于37℃含5％CO2空气的培养箱内培养；S3：原代细胞流式细胞仪检测：纯化后的细胞取少量应用流式细胞仪进行细胞表型的鉴定，具体步骤为：细胞用胰酶消化后，用PBS液调整细胞浓度为1*10⁶/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29‑FITC、CD34‑FITC、CD44‑PE、CD45‑PE、CD73‑PE、CD90PE、CD105‑FITC、CD106‑PE、CD166‑FITC、HLA‑DR‑PE，置4℃孵育30min,PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析；S4：体外诱导人类羊膜间充质细胞分化为胰岛素分泌细胞，分为3个阶段:诱导MSCs分化为巢蛋白阳性细胞(DMEM培养基+5mmol/L 2‑巯基乙醇培养5h)；诱导巢蛋白阳性细胞扩增并分化为前体细胞(细胞接种于涂有Matrigel的培养板,在DMEM培养基+B27+10μg/L bFGF+0.1mmol/L 2‑巯基乙醇+ITS中培养7天)；诱导胰岛素分泌细胞成熟(DMEM培养基+B27+10μg/L HGF+20mmol/L烟酰胺+0.1mmol/L 2‑巯基乙醇+LY294002培养7～21天；S5：诱导后细胞形态、功能鉴定RT‑PCR方法:Trizol试剂提取细胞总RNA,紫外分光光度计对RNA样品定量后通过RT‑PCR进行产物扩增,琼脂糖凝胶电泳检测；诱导第28天,胰岛素‑1、Pdx‑1、Pax‑6mRNA表达显著高于第7天和第14天；收集24h培养基,以放射免疫法测定胰岛素累积分泌量；进行胰岛素刺激实验。