[发明专利]将脐带间充质干细胞诱导分化成γ-氨基丁酸能神经元的方法

摘要

公开了一种将脐带间充质干细胞诱导分化成γ‑氨基丁酸能神经元的方法。该方法采用预诱导和诱导二步结合法，并配制了优化的预诱导培养液和诱导培养液，其中通过加入结构改进的苷类化合物作为诱导物，成功诱导脐带间充质干细胞分化成γ‑氨基丁酸能神经，并且分化比例较高。

主权项

1.一种将脐带间充质干细胞诱导分化成γ‑氨基丁酸能神经元的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1) 脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干细胞单体按1‑5×105/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，每3‑8天换液传代一次，得到培养的细胞；其中所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12基本培养基，2％B27，2‑4mM L‑谷氨酰胺，1mM硫代甘油，1％非必需氨基酸，EGF 20‑40ng/ml，bFGF 20‑30ng/ml，80‑90U/ml青霉素，60‑70μg/ml链霉素；和步骤(2) 预诱导分化：将步骤(1)得到的培养细胞按1～5×104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3‑4天时终止诱导；其中在该步骤的培养过程中，在培养液中添加苷类诱导物和全反式维甲酸，并且保持培养液中所述苷类诱导物的浓度为5‑10μg/mL，所述全反式维甲酸的浓度为5‑10μmol/L；并且，其中所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nM～50nM的维生素C，10‑20U/ml人白细胞抑制因子，1‑8mM L‑谷氨酰胺，2‑5mM硫代甘油，80‑100U/ml青霉素，80‑100μg/ml链霉素，所述预诱导培养液另外含有0.01M磷酸盐缓冲液；所述苷类诱导物为下面结构式（I）所示的苷类物质：（I）；在所述步骤(2)中，培养液的pH维持在7.2‑7.8；和步骤(3) 诱导分化：将步骤(2)得到的细胞按1～5×104/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3‑6天时终止诱导，得到神经细胞；所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol～50nmol的维生素C，30nM～40nM的维生素B1，0.01‑0.02％的二甲基亚砜，0.1mM 2‑β‑巯基乙醇，10‑20U/ml人白细胞抑制因子，10‑30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，1‑8mM L‑谷氨酰胺，2‑5mM硫代甘油，80‑100U/ml青霉素，80‑100μg/ml链霉素；具有结构式（I）的物质通过如下方法合成：将磷腺苷与甲醇以1:（1～1.5）的摩尔比加入到三氯甲烷溶剂中，然后加入铁改性的HZSM‑5分子筛这样的选择性催化剂，使用苯作为带水剂，反应温度为50‑80℃，反应时间为1‑3小时，即可制得所述物质。