[发明专利]基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法

摘要

本发明公开了一种基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法，属于电化学传感技术领域。含有甲基化位点的发夹DNA在Dam甲基转移酶的作用下发生甲基化并被DpnI核酸内切酶剪切，释放出的单链DNA与电极表面的二茂铁‑DNA的凸起部分杂交形成双链DNA进而被核酸外切酶III剪切为DNA碎片，使得二茂铁脱离电极表面而电流降低，电极表面的单链DNA与血红素形成G‑四链体‑血红素复合物的电流增强，通过二者电流强度的比例可实现Dam甲基转移酶的灵敏检测。

主权项

基于双电信号和DNA循环放大技术的Dam甲基转移酶活性检测方法，其特征在于，在含有5’‑G‑A‑T‑C‑3’序列的发夹DNA溶液中加入Dam甲基转移酶，孵育，Dam甲基转移酶将S‑腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到发夹DNA的腺嘌呤的N6位置上；将溶液在65 °C加热15分钟后冷却到室温，加入Dpn I孵育，Dpn I将发生甲基化的发夹DNA从甲基化位点剪切为DNA碎片，释放出单链DNA；将预先制备好的二茂铁‑DNA修饰金电极浸泡在以上溶液中，释放出的单链DNA与二茂铁‑DNA的凸出部分杂交形成双链DNA，加入核酸外切酶III孵育，核酸外切酶III从双链DNA的3’端进行剪切，释放出的单链DNA继续与电极表面的二茂铁‑DNA的凸出部分杂交形成双链DNA而进入下一个剪切放大循环，如此循环，使得大量二茂铁脱离电极表面导致二茂铁的电流下降，同时电极表面的大量巯基化单链DNA被释放出来，将电极浸泡在含有血红素和钾离子的溶液中，形成的G‑四链体‑血红素复合物的电流增强，通过电化学工作站测量二茂铁和G‑四链体‑血红素复合物的电流，根据二者电流强度的比值与Dam甲基转移酶浓度的对数的线性关系实现Dam甲基转移酶的检测；二茂铁‑DNA修饰金电极按下述步骤制备：（1）电极预处理：金电极用新鲜配制的体积比为7:3的H2SO4:H2O2溶液浸泡20分钟，用超纯水冲洗电极，再分别用0.3 µm和0.05 µm的氧化铝粉在麂皮上抛光至金电极表面呈镜面，将电极分别在体积比为1:1的HNO3:H2O、乙醇和超纯水中分别超声1分钟，将清洗干净的电极在0.1 M的H2SO4溶液中于‑0.2 V到+1.55 V电位范围内进行循环伏安扫描，直到获得稳定的循环伏安峰；（2）制备二茂铁‑DNA修饰金电极：巯基化DNA用100 μL 1 mM的二硫苏糖醇溶液活化3小时后过柱；将步骤（1）处理好的金电极浸泡在50 µL 1µM活化后的巯基化DNA溶液中，室温下反应16小时，用超纯水清洗电极表面去除未反应的巯基化DNA；将电极浸入0.1 M巯基己醇溶液中30分钟后，再浸泡在50 µL 1µM的二茂铁‑DNA溶液中，在37 °C反应2小时，用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液清洗电极表面，即制成二茂铁‑DNA修饰金电极。