[发明专利]一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法

摘要

本发明公开了一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。所述高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌通过如下方法构建获得：将用于表达普鲁兰酶的人工操纵子BPB构建重组质粒pGE‑BPB；所述人工操纵子BPB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；将前述构建的重组质粒pGE‑BPB转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞中，通过二次重组使人工操纵子BPB原位替代枯草芽孢杆菌感受态细胞中的中性蛋白酶基因nprE。本发明从优化原始菌株的耐酸热普鲁兰酶基因开始，利用合成生物学的方法，将多种可以提高基因转录水平的分子元件组装成一个人工操纵子，构建得到重组枯草芽胞杆菌，该重组菌株可发酵高产普鲁兰酶，单位酶活达到或超过300U/ml。

主权项

1.一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：将含有表达普鲁兰酶基因的人工操纵子BPB原位替代枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶基因nprE，得到所述重组枯草芽孢杆菌；所述人工操纵子BPB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述人工操纵子BPB通过重组质粒pGE‑BPB转入枯草芽孢杆菌中，所述重组质粒pGE‑BPB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述人工操纵子BPB包含有经密码子优化获得的pulB基因，所述pulB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法包括如下步骤：步骤1，将用于表达普鲁兰酶的人工操纵子BPB构建重组质粒pGE‑BPB；所述人工操纵子BPB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；步骤2，将重组质粒pGE‑BPB转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞中，所述重组质粒pGE‑BPB通过二次重组方式将枯草芽孢杆菌感受态细胞中的中性蛋白酶基因nprE敲除，具体如下：将重组质粒pGE‑BPB转入枯草芽胞杆菌168中，通过含有红霉素的培养板筛选获得抗性菌株，以普鲁兰酶基因pulB为模板，设计引物，通过PCR鉴定出阳性克隆后，将筛选获得的整合了普鲁兰酶及抗生素基因的抗性菌株接种到不含抗性的培养基中进行连续传代培养，传5‑6次后，将菌液稀释到103‑104/ml的细胞浓度，然后进行涂板，对获得的单克隆菌落再进行PCR的鉴定，根据重组菌中普鲁兰酶基因的获得确定出人工操纵子BPB序列原位替代了nprE的无抗重组克隆。