[发明专利]一种阿魏酸酯酶的生产方法

摘要

本发明提供了一种阿魏酸酯酶的生产方法，属于生物酶制剂生产技术领域。该方法是利用组成型表达阿魏酸酯酶的基因工程菌株，以淀粉糖化液、玉米浆和氨水等为主要原料发酵产生阿魏酸酯酶。在发酵工程中连续补加发酵培养基和批式排出部分发酵液，在无杂菌污染的条件下持续延长发酵周期，发酵液经板框过滤、超滤浓缩和喷雾干燥后可制得高活力的阿魏酸酯酶制剂，具体步骤如下：（1）菌种制备；（2）扩大培养；（3）液体深层发酵生产阿魏酸酯酶：（4）阿魏酸酯酶的提纯。利用本发明可以在无严重杂菌污染和单位发酵液中的酶活力无显著降低的情况下实现持续发酵、持续生产，可以缩短生产周期，降成生产成本。

主权项

一种阿魏酸酯酶的生产方法，所述方法利用组成型表达阿魏酸酯酶的基因工程菌株，以淀粉糖化液、玉米浆和氨水等为主要原料发酵产生阿魏酸酯酶，其特征在于：在发酵工程中连续补加发酵培养基和批式排出部分发酵液，在无杂菌污染的条件下持续延长发酵周期，通过对发酵液中的阿魏酸酯酶提取可制得高活力的阿魏酸酯酶制剂，具体步骤如下：（1）菌种制备：（1.1）将组成型表达阿魏酸酯酶A毕赤酵母菌株按重量百分比1%接种到500mL已灭菌培养基中，在28~30 ℃、200~240 rpm条件下培养48~60小时，作为种子液备用；其中培养基是由下述质量百分比的原料组成：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、余量为水；（1.2）在50L的发酵罐中制备30 L已灭菌培养基：按质量百分比取工业级原料： 2%淀粉水解液、1%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1mL/m3微量元素母液，120~124℃灭菌30分钟，作为种子液培养基备用； （1.3）将步骤（1.1）制备的种子液转入步骤（1.2）制备的含有30 L已灭菌培养基的50L的发酵罐中，在28~30 ℃、pH5.8~6.4、180~200 rpm条件下培养32~48小时；（2）扩大培养：（2.1）按照步骤（1.2）的方法在6 m3发酵罐内中制备4 m3灭菌培养基，待灭菌培养液温度降至35℃后备用；（2.2）将步骤（1.3）中制备的30L菌种液转入步骤（2.1）制得的培养液中；在28~30℃、溶氧量为8mg/L~10mg/L、罐压为0.05Mpa的条件下培养24~36小时，得到扩大培养种子液备用；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至5.8~6.4，使发酵菌株处于适宜的生长pH；（3）液体深层发酵生产阿魏酸酯酶：（3.1）在60m3发酵罐中制备40m3发酵培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在115~121℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；（3.2）在60m3发酵罐中制备40m3补料培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在115~121℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；（3.3）将步骤（2.2）中所得扩大培养种子液转移入到步骤（3.1）所得发酵培养基中进行发酵；在温度为28~30 ℃，溶氧量为条件下8mg/L~10mg/L，罐压为0.05~0.06Mp条件下培养，当还原糖降低到1.5%时，开始加入步骤（3.2）所得补料培养基进行补料，补料速率参照还原糖百分比；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至5.8~6.4，是发酵菌株处于适宜的生长pH；从接入扩大培养种子液开始计时，48小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时放出首次发酵液20~25 m3；以后每24小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时可再次放出一半发酵液；在发酵过程中应及时跟踪发酵液中杂菌污染状况和单位发酵液中的酶活力两个指标；在无严重杂菌污染和单位发酵液中的酶活力无显著降低的情况下，该发酵周期可持续延长；（4）阿魏酸酯酶的提纯：利用100~160 m2 聚丙烯板框过滤机将发酵液过滤得到阿魏酸酯酶清液后，利用分子截留量为10000道尔顿超滤设备将阿魏酸酯酶清液进行浓缩10倍，然后采用1000kg/h压力喷雾干燥设备制成粉状阿魏酸酯酶，喷雾干燥进口温度130~140℃，出口温度50~60℃。