[发明专利]一种新型抗菌脂肽[△Leu3]Surfactin、制备方法及应用

摘要

本发明属于微生物发酵生产领域，提供一种新型抗菌脂肽，命名为[ΔLeu³]Surfactin，共有3种组分，包括C13的抗菌脂肽类化合物1、包括C14的抗菌脂肽类化合物2、包括C15的抗菌脂肽类化合物3，分子量分别为909、923、937Da。本发明还提供产该抗菌脂肽工程菌枯草芽孢杆菌LS1菌株的构建方法及该抗菌脂肽的制备过程和应用。[ΔLeu³]Surfactin是一种新型surfactin类抗菌脂肽，相比于surfactin其具有较弱的溶血活性，但对短小芽孢杆菌、藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌都有抑制作用，能够防治多种植物病害，其毒性较低，在生物防治、食品加工和农产品贮藏保鲜等方面具有应用潜力。

主权项

1.一种抗菌脂肽的制备方法，其特征在于：将目的基因D‑Leu模块删除后的surfac tinA上下游序列与pKS2载体连接，获得重组载体pKS2‑srfA‑A‑△Leu；以重组载体pKS2‑srfA‑A‑△Leu转化枯草芽孢杆菌PB2‑L1，通过PKS2质粒诱导敲除、筛选，获得产[△Leu³]Surfactin的工程菌枯草芽孢杆菌LS1菌株；将枯草芽孢杆菌LS1活化，制成浓度为10⁷～10⁸cfu/l的种子液；将枯草芽孢杆菌LS1种子液以5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30℃和150rpm条件下培养72h，得到抗菌脂肽发酵液；将抗菌脂肽发酵液在5000r/min下离心25min除去菌体，上清液调pH至2.0，低温4℃过夜，5000r/min离心20min取沉淀，用甲醇溶解，调节pH至7.0，于磁力搅拌器上4℃低温搅拌5h，10000r/min离心20min后得到的上清液即为[△Leu³]Surfactin粗提物；将[△Leu³]Surfactin粗提物进一步进行纯化，过程为：将[△Leu³]Surfactin粗提物采用RP‑C18柱进行HPLC分离纯化；洗脱液为含3.8mmol三氟乙酸的水和乙腈溶液，洗脱柱为4.6mmΦ×250mm；梯度洗脱条件为：0～10min，60％体积B相、40％体积A相；10～20min，93％体积B相、7％体积A相；流速为0.83ml/min；检测波长为210nm；HPLC洗脱保留时间为16～17min，获得纯化抗菌脂肽[△Leu³]Surfactin；其中，B相为3.8mmol三氟乙酸的乙腈溶液，A相为含3.8mmol三氟乙酸的水；其中，产[△Leu³]Surfactin的工程菌枯草芽孢杆菌LS1菌株得构建方法如下：(1)以枯草芽孢杆菌PB2‑L1菌株总DNA为模板，引物对5′srfA‑A‑△Leu‑up‑F和3′srfA‑A‑△Leu‑up‑R进行上游片段PCR扩增，5′srfA‑A‑△Leu‑down‑F和3′srfA‑A‑△Leu‑down‑R进行下游片段PCR扩增；其中，5′srfA‑A‑△Leu‑up‑F序列为：5′‑CAAGATACGTATCCT‑3′、△srfA‑A‑△Leu‑up‑R序列为：5′‑AGTCGGAAGCGTCAG‑3′；5′srfA‑A‑△Leu‑down‑F序列为5′‑CAGGAGGGAATGCTG‑3′、3′srfA‑A‑△Leu‑down‑R序列为5′‑CCACTTGATGTAATC‑3′；(2)以步骤(1)获得的上游和下游片段为模板、上下游连接序列引物：5′srfA‑A‑△Leu(KpnI)‑F和3′srfA‑A‑△Leu(XhoI)‑R进行重叠PCR，获得D‑Leu模块删除后的surfactinA上下游序列连接产物即重叠PCR连接产物；其中，5′srfA‑A‑△Leu(KpnI)‑F的序列如5′‑GGTACCCAAGATACGTATCCT‑3′所示，3′srfA‑A‑△Leu(XhoI)‑R的序列如5′‑CTCGAGCCACTTGATGTAATC‑3′所示；(3)将获得的重叠PCR连接产物与质粒PMD‑19T重组，获得重组质粒PMD‑19T‑△Leu；(4)以Kpn I和XhoI双酶切重组质粒PMD‑19T‑△Asp获得目的基因D‑Leu模块删除后的surfactinA上下游序列；所述的PKS2质粒诱导敲除、筛选过程为：将转化了重组载体pKS2‑srfA‑A‑△Leu的枯草芽孢杆菌PB2‑L1单克隆接种到LB液体培养基中，37℃下转接3代后，培养过夜，涂布5mg/L卡那霉素浓度的Kan平板并置于37℃下培养，转接3代后，长出的枯草芽孢杆菌单菌落即为发生同源重组单交换的转化子；转接重组单交换的转化子到LB中，30℃下培养36h后，涂布到LB平板，置于37℃下培养12h后随机挑取平板中3000个单菌落接种于Kan平板，选择Kan平板上不生长的对应的在LB平板上生长的单菌落就是疑似枯草芽孢杆菌敲除株；对疑似枯草芽孢杆菌进行PCR进一步鉴定获得枯草芽孢杆菌敲除株，其过程为：以疑似枯草芽孢杆菌敲除株单菌落总DNA为模板，上下游连接序列引物5′srfA‑A‑△Leu(KpnI)‑F和3′srfA‑A‑△Leu(XhoI)‑R引物、pKS2质粒验证引物PKS‑1058‑ERM‑F和PKS‑1058‑ERM‑R进行PCR鉴定，如果扩增出1107bp条带，说明上下游连接序列已经成功导入到枯草芽孢杆菌基因组中，枯草芽孢杆菌敲除株LS1成功获得。