[发明专利]一种快速检测纺织品中白假丝酵母菌的方法

摘要

本发明涉及纺织品微生物鉴定领域，特别是一种快速鉴定纺织品中白假丝酵母菌的方法，针对现有纺织品中白假丝酵母菌鉴定过程中所存在的问题，其解决问题的技术方案是一种快速鉴定纺织品中白假丝酵母菌的方法，包括以下步骤：步骤一：检样采集；步骤二：样液制备；步骤三：样液稀释，过滤；步骤四：白假丝酵母菌检测培养；步骤五：Biotyper系统标准品溶液和基质溶液的制备；步骤六：用甲酸提取法提取菌落蛋白；步骤七：MALDI BioTyper自动鉴定；步骤八：结果计算：本发明中纺织品中白假丝酵母菌鉴定方法考虑了各种样品面积的大小、及厚度，采集的样品更具代表性，使检测结果更准确，该方法高度自动化，减少实验误差，不需要其他附加实验，节约检测成本。

主权项

一种快速检测纺织品中白假丝酵母菌的方法，包括以下步骤：步骤一：检样采集在送检的纺织品四周和中间均匀布控5个～10个采样点，用灭菌不锈钢直尺测量，根据纺织品面积大小，每件纺织品共采集5份～10份检样；采样面积可按送检的纺织品面积大小扩大或缩小；步骤二：样液制备将采集好的5份～10份检样放入盛有200mL灭菌生理盐水的全滤网无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，得到一个生理盐水样液，制成样液作为原液，如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，灭菌生理盐水量可按每次100mL递增，直至能抽提有足够100mL～120mL的测试样液；每个样液30min内抽提检测完毕；步骤三：样液稀释，过滤将步骤二制备的样液稀释后用滤膜过滤备用，每张滤膜过滤100mL样液，应根据样品污染情况确定样液的稀释倍数，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于100个菌落为宜，如果样品污染严重，可将样液原液按10倍递增稀释，取100mL稀释液过滤；步骤四：白假丝酵母菌检测培养用无齿灭菌镊子夹取孔径为0.45μm微孔灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将过滤后的样液注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5×10⁵Pa下抽滤，样液滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在孟加拉红培养基平板上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不留气泡，然后将孟加拉红平板放入28℃±1℃培养箱内培养24h～48h，白假丝酵母菌在孟家拉红培养基养出的菌落具有以下特征，浅粉色大的形状不规则菌落，中心凹陷，边缘色浅不整齐，表面干燥，有的菌落有明显菌丝，酿酒酵母菌在孟家拉红培养基培养出的菌落具有以下特征：无菌丝，边缘整齐，浅粉色，中心凹陷的大菌落；每个平板上挑取5个可疑菌落，用微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)进行验证；步骤五：微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)专用的标准品溶液和基质溶液的制备使用微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)专用的标准品Bacterial Test Standard(BTS)加入标准溶剂50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸50μl，使用移液器反复吹吸的方式，溶解BTS粉末(不能剧烈震荡溶解)；室温放置5min，之后重复吹吸，13000rpm离心2min，分装，‑20℃冰箱保存，禁止反复冻融溶解好的BTS，每次使用取一管；使用微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)专用的基质HCCAportioned加入50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸50μl)250μl标准溶剂(终浓度10mg/mL)，振荡混匀，直到形成澄清溶液；步骤六：用甲酸提取法提取菌落蛋白在EP管中加入300μl去离子水，取待测微生物样本至离心管中，使用移液枪吹吸或涡旋振荡充分混匀，加入900μl乙醇，充分混匀；13000rpm离心2min，倒去上清，再次离心，使用移液枪完全去除残余的上清液，整个过程不应触碰沉淀；室温下干燥沉淀2min～3min；加入70％甲酸水溶液1μl～80μl，根据生物样品量能充分混合为准，通过移液枪吹吸或者涡旋振荡充分混合，加入与甲酸等体积纯乙腈，充分混匀，13000rpm离心2min，吸取1μl上清，滴加到MALDI靶板上，并在室温下晾干，1h内，用1μl HCCA基质溶液覆盖上述样液点，并在室温下晾干；步骤七：微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)自动鉴定将靶板放入仪器，自动鉴定结果，与标准图谱对照确定白假丝酵母菌；步骤八：结果计算：然后由步骤七鉴定出的结果来直接计数孟加拉红培养基平板上对应为白假丝酵母菌特征菌落，以每平方厘米样液中的白假丝酵母菌个数报告结果,按式(1)计算，如果样品原液培养基上无菌落长出，结果报告为0CFU/cm²；如果10倍样品稀释液培养基上无菌落长出，结果报告为＜10 CFU/cm²；若检测为白假丝酵母菌，则选择培养基上菌落数小于100 CFU的平板计数，按式(1)计算报告。根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中白假丝酵母菌的方法，其特征在于步骤一中检样采集每个采样点按5cm×5cm面积范围剪裁，每25cm²采样面积为1份检样。根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中白假丝酵母菌的方法，其特征在于步骤七中微生物自动检测所用仪器为微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)。