[发明专利]一种从海南拟盘多毛孢菌代谢产物中提取紫杉醇的方法

摘要

本发明公开了一种从海南拟盘多毛孢菌代谢产物中提取紫杉醇的方法，包括以下步骤：菌体的培养及发酵；次级代谢产物的提取；柱层析纯化。本发明方法所提取的海南拟盘多毛孢真菌产的紫杉醇，和标准紫杉醇有相同的结构，且产量为1466.87μg/L。大熊猫皮屑中的这种真菌，产紫杉醇的量显著高于来自非动物来源的真菌。真菌生产紫杉醇可能是一个为紫杉醇工业规模化生产的潜在候选方法。

主权项

一种从海南拟盘多毛孢菌代谢产物中提取紫杉醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：菌体的培养及发酵将分离自大熊猫体表的海南拟盘多毛孢菌株接种到PDA固体培养基上，28℃避光培养，镜检产孢后，用20ml无菌生理盐水冲洗菌落制成混悬液，将混悬液移入一无菌试管，密闭放入涡流器15s，使菌悬液充分混匀；然后用移液器将制备好的菌悬液转入CPDA发酵液，用震荡培养箱，28℃、200r/min恒温震荡培养21～28天；步骤2：次级代谢产物的提取CPDA发酵液4℃，10000r/min，离心10min，分别收集上清液和菌丝体；加入0.5gNaCO₃到上清液中，同时加入NaCl，用等体积的乙酸乙酯：丙酮萃取三次，每次4h，向菌丝体加入甲醇搅拌均匀，用超声破碎仪破碎细胞后冷冻24h，经离心得有机相和菌丝体，菌丝体再进行索氏提取8h，溶剂为二氯甲烷，然后合并上述三部分有机相于旋转蒸发仪上35℃旋转浓缩成浸膏状，浸膏溶于10ml甲醇用于柱层析；步骤3：柱层析纯化AB‑8大孔树脂进行预处理后，湿法装柱；用无水乙醇以1.0ml/min的流速冲柱稳定后，用浓度为30％、40％、50％、60％、70％的乙醇溶液进行洗脱，流速为1.5ml/min，收集洗脱液，进行TLC检测，展层体系，在254nm紫外灯下观察荧光，再用1％香草醛的浓硫酸喷雾显色，观察有无紫杉作对照，收集上述具有特征性蓝斑的洗脱液，经浓缩后再重复过柱两次得到纯化后的样品。