[发明专利]一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法

摘要

本发明公开了一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法，该方法包括如下步骤重楼种子的预处理→重楼珠心细胞的预培养→重楼珠心细胞的悬浮培养→细胞的继代培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的重楼细胞培养物。

主权项

一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤：(1)重楼种子的预处理：选取尚未完全成熟的重楼果实，去掉果皮后先进行浸泡，然后将浸泡后的重楼种子搓去外种皮后，再用升汞溶液进行消毒，将消毒后的重楼种子用无菌水冲洗后，用滤纸吸干内种皮表面的水分，再用小刀划伤重楼种子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子在温度为25～30℃、光照强度为1500～2000lx的条件下放置3～5小时， 使重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量重楼珠心细胞；(2)重楼珠心细胞的预培养：取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超净工作台上用0.1％的升汞溶液消毒2～4分钟，用无菌水冲洗后，用解剖刀切取重楼种子的珠心细胞接入液体培养基B5+赤霉素200‑600mg/L+KT1.0‑3.0mg/L+IAA 0.5‑1.5mg/L中进行25～35天的预培养；(3)重楼珠心细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部或/和下部的重楼珠心细胞和细胞团块，以40～80g·L‑1的接种量转接到B5+6‑BA0.5～2.0mg/L+NAA 0.5～2.0mg/L+2,4‑D 1.0～3.0mg/L液体培养基中进行细胞悬浮培养；(4)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了40～60天进行第一次继代培养，以后每隔35～45天继代一次，每次的接种量为30～60g·L‑1；上述(2)、(3)、(4)步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度20～25℃，pH值5.0～7.0，无光照，摇床转速为120～180r·min‑1。