[发明专利]基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法

摘要

本发明公开了一种基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，包括血液游离DNA提取、片段大小筛选、末端修复、3’端添加接头、PCR扩增、磁珠纯化等步骤。与以往基于测序平台的建库流程相比，本发明建库方法简化了实验流程，缩短建库时间，优化了反应体系，大幅度的减少试剂用量，降低建库成本，并降低了文库的损失，适用于人为片段化的小DNA文库的构建。

主权项

一种基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)血液游离DNA提取：采用磁珠法从样品中提取血液游离DNA；(2)片段大小筛选：利用磁珠对步骤(1)DNA进行片段大小筛选及纯化；(3)末端修复：将步骤(2)得到的DNA与试剂1混合，在PCR仪上按22℃20min，72℃20min的程序进行孵育反应；(4)3’端添加接头：将步骤(3)所得的反应体系与试剂2混合，在PCR仪上按22℃15min，72℃20min的程序进行孵育反应；之后磁珠纯化；(5)PCR扩增：将步骤(4)得到的DNA片段加入试剂3进行PCR扩增；(6)磁珠纯化：将步骤(5)所得扩增产物利用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；其中，步骤(3)所述试剂1的pH值为7.5，成分为去离子水、50mM Tris‑HCl、10mM MgCl₂、10mM二硫苏糖醇、1mMγ‑32p‑ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4 DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶；步骤(4)所述试剂2的pH值为7.6，成分为去离子水、25uM DNA Adpter、200U/ul T4DNA连接酶、10mM MgCl₂、50mM Tris‑HCl、50wt％甘油、1mM ATP、5mM dNTPs；步骤(5)所述试剂3的pH值为7.6，成分为去离子水、100mM Tris‑HCl、5mM MgCl₂、250uM dNTPs、10U/ul Taq DNA聚合酶和12.5mM引物混合液。