[发明专利]微泡菌属细菌生物合成对羟基苯甲酸和酯类的方法

摘要

一种微泡菌生物合成对羟基苯甲酸和酯类的方法。对羟基苯甲酸是合成液晶等用途广泛的有机合成原料，其酯类有抑菌活性，作为防腐剂广泛应用于食品和化妆品的保存上。我们从海洋中发现一种拥有天然合成对羟基苯甲酸和酯类的微泡菌。该菌株培养液中对羟基苯甲酸的最终积累浓度为10mM。合成的酯类包括对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、庚酯和壬酯，各个的合成量大约是2mM。为了获得对羟基苯甲酸，在海水培养基中加入2％葡萄糖培养A4B菌株至稳定期，用盐酸调成酸性后乙酸乙酯萃取可得。在中性条件下萃取培养液可获得酯类。利用该细菌可以从可再生资源生物合成工业原料的对羟基苯甲酸和其酯类，可降低人类对石化资源的过分依赖。

主权项

一种微泡菌属细菌生物合成对羟基苯甲酸和酯类的方法，其特征是：a、筛选分离天然合成对羟基苯甲酸和酯类的A4B菌株制备含有指示菌柱的平板，在液体的人工海水培养基中加入2％的琼脂，高压加热灭菌后，温度降到大约50℃，琼脂凝固之前参入细胞浓度为10⁸/L的B.subtilis 1ml，混匀后制备成平皿；然后在平皿的中央位置放上一个滤纸片，在滤纸片上滴入待筛选菌株的培养液；将平皿放在37度培养箱培养；利用上述方法筛选到一个形成抑菌圈的细菌，即A4B菌株；在人工海水培养基中加入2％的葡萄糖作为碳源培养A4B菌株，然后利用液相色谱分析了次级代谢产物；A4B菌株合成积累对羟基苯甲酸；A4B菌株还合成了对羟基苯甲酸甲酯(Methyl 4HBA)，对羟基苯甲酸乙酯(Ethyl 4HBA)，对羟基苯甲酸丙酯(Propyl 4HBA)，对羟基苯甲酸丁酯(Butyl 4HBA)，对羟基苯酸庚酯(Heptyl 4HBA)和对羟基苯酸壬酯(Nonoyl 4HBA)，各个的合成量大约是2mM；b、菌株鉴定提取A4B菌株的总DNA，然后PCR扩增16S rDNA，将PCR产物提纯后进行碱基测序；通过对序列进行数据库检索和系统进化树构建后，判明A4B菌株属于Microbulbifer微泡菌，所述的微泡菌广泛存在于世界各地的海洋环境中；c、利用A4B菌株生物合成对羟基苯甲酸步骤：(1)准备10ml的含有1％葡萄糖的海水培养基，海水培养基的成分；ONR7a是人工海水培养基，成分如下表。表  ONR7的组成(2)接种A4B菌株培养24小时，培养温度为35℃这个培养过程是预培养，得到的培养液是预培养液；(3)准备10L的发酵罐，装入8L的含有1％葡萄糖的海水培养基；(4)接种10ml预培养的菌液，在35℃培养到稳定后期，利用液相色谱检测葡萄糖消耗完后停止培养；(5)离心将菌体除去，收集上清液体，加入盐酸将液体的pH调成酸性；(6)加入和上清等量的乙酸乙酯萃取对羟基苯甲酸；(7)收集含有对羟基苯甲酸的乙酸乙酯相，利用蒸发仪蒸发乙酸乙酯，获得对羟基苯甲酸。d、利用A4B菌株生物合成对羟基苯甲酸酯类的步骤：(1)准备10ml的含有1％葡萄糖的海水培养基；(2)接种A4B菌株培养24小时，培养温度为35℃这个培养过程是预培养，得到的培养液是预培养液；(3)准备10L的发酵罐，装入8L的含有1％葡萄糖的海水培养基；(4)接种10ml预培养的菌液，在35℃培养到稳定后期，利用液相色谱检测葡萄糖消耗完后停止培养；(5)离心将菌体除去，收集上清液体；(6)加入和上清等量的乙酸乙酯萃取对羟基苯甲酸；(7)收集含有对羟基苯甲酸的乙酸乙酯相，利用蒸发仪蒸发乙酸乙酯，获得对羟基苯甲酸酯类。