[发明专利]一种重组人胸腺法新的高密度发酵方法

摘要

本发明涉及生物制药技术领域，具体地提供一种重组人胸腺法新的高密度发酵方法。根据本发明的重组人胸腺法新的高密度发酵方法，包括以下步骤：1)工作种子培养；2)接种于发酵罐发酵；3)诱导前补料；4)诱导表达。本发酵方法可实现在55L规模发酵中重组人胸腺法新的高效表达，最终菌体浓度OD₆₀₀可达90以上，且融合蛋白表达量占菌体总蛋白的45％以上，使重组人胸腺法新的发酵工艺规模达到了世界先进水平，并解决了重组人胸腺法新表达量低和产率达不到规模化要求的技术难题，为重组人胸腺法新的产业化奠定了坚实基础。

主权项

一种重组人胸腺法新的高密度发酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)工作种子培养：将工作种子库的菌种接种于一级种子培养基中，置于摇床进行培养，控制温度35‑37℃，转速200‑230rpm，培养7‑9h，得到一级种子液；将一级种子液以2‑5％的接种量接种于二级种子培养基中，置于摇床进行培养，控制温度35‑37℃，转速200‑230rpm，培养15‑17h，即得到发酵工作种子液；2)接种于发酵罐发酵：将制备好的发酵工作种子液以5‑15％的接种量接种于含发酵培养基的发酵罐中进行发酵，机械搅拌转速为150‑500rpm，通气量为10‑80L/min，罐压为0.2‑0.4par，维持溶氧水平在20‑60％，发酵温度为35‑37℃，加入25‑28％(v/v)氨水控制发酵pH在6.8‑7.2；3)诱导前补料：紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为1.0‑1.5时，开始以2.5mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，发酵过程中每隔1h进行离线检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度反馈补料，控制葡萄糖浓度在0.8‑1.2g/L；紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为30‑35时，以5‑7mL/L·h的流速开始补加有机氮源补料培养基；其中所述的碳源补料培养基为50％葡糖糖溶液，所述的有机氮源补料培养基为200％胰蛋白胨与酵母粉(1∶3)混合溶液；4)诱导表达：紫外分光光度计测定菌体浓度OD₆₀₀为70‑90时，向发酵罐中加入含异丙基硫代半乳酸糖苷(IPTG)的水溶液，至IPTG终浓度为0.5‑0.7mM，10min后开始以12‑14mL/L·h的流速补加碳源补料培养基，同时以12‑14mL/L·h的流速补加有机氮源补料培养基，同时将发酵温度调为30℃，开始进行目的蛋白诱导表达4‑5h。