[发明专利]一种水稻种胚POD测定方法

摘要

本发明公开了一种水稻种胚POD测定方法，包括以下步骤提取液和检测液的配制、取样、胚POD酶液的提取、胚POD酶活性的测定、本发明研制了一种特殊的提取液，利用Tween20的解脂作用和甘油对POD活性的保护作用，使POD与脂肪充分分离和酶活得到甘油的充分保护，从而能较准确地检测干种子POD活性。

主权项

一种水稻种胚POD测定方法，其特征在于：包括以下步骤;(1) 胚POD提取液的配制：先配制0.1M pH 8.5 Tris‑HCl 缓冲液：A液，取3.0285g Tris，溶解，定容至250ml；B液，取1ml浓盐酸，稀释120倍；取250mlA液和73.5mlB液，混匀，定容至500ml，用pH试纸校准；再在每100毫升0.1M pH 8.5 Tris‑HCl 缓冲液中加入10%甘油，2.5% Tween20，(2)种子胚POD检测液的配制：先配制0.2M pH 6.0磷酸缓冲液：A液，取15.605g 磷酸二氢钠二水合物，溶解，定容至500ml；B液，取7.164g磷酸氢二钠十二水合物，溶解，定容至100ml，取438mlA液和62mlB液，混合，定容至500ml；再取配好0.2M pH 6.0磷酸缓冲液50ml，过氧化氢0.028ml，愈创木酚0.019ml混合；(3)取样水稻每个材料种子100粒，去壳，用刀片切或镊子挖取70mg水稻胚，置于‑80℃冰箱，待用，(4)胚POD酶液的提取定量称取20mg胚，置于研钵中，加上述2ml胚POD提取液，研磨成匀浆，再加2ml分两次洗涤，至研磨总体系4ml，4000rpm离心10min，取上清液1.5ml即为粗酶提取液；(5)胚POD酶活性的测定向比色皿加入1.5ml粗酶提取液，再加入反应液2.5ml，每隔1min读数一次，以0.2M pH 6.0磷酸缓冲液为对照调零，470nm处测定5min的OD变化值，做3个重复，计算平均值； (6)结果计算后，即可。