[发明专利]一种从脐带制备间充质干细胞的方法

摘要

本发明涉及一种从脐带制备间充质干细胞的方法，以及利用该方法制备的间充质干细胞。所述方法包括下述步骤(1)取脐带样品；(2)去除血管以及其周围紧贴血管的组织；(3)制备脐带组织片；(4)分离羊膜下层组织；(5)对羊膜下层组织进行处理；(6)无细胞培养液培养；(7)加入细胞培养液继续培养；(8)胰酶消化；(9)过滤；(10)将滤液离心并去除上清，重新悬浮获得脐带组织间充质干细胞。利用本发明的方法制备的间充质干细胞纯度高，增殖和分化潜能大，在基础研究和临床治疗中具有广泛的应用前景。

主权项

一种从脐带制备间充质干细胞的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)取新生儿的脐带，用磷酸盐缓冲液反复冲洗干净，去除残留的血液，获得干净脐带；(2)将干净的脐带用手术刀纵向切开，用镊子去除静脉血管和动脉血管以及其周围紧贴血管的组织；(3)将剩下的组织摊平，脐带内侧朝上，用镊子小心剔除脐带内侧胶质部分，剥除干净，直至剩下约1mm厚度的组织片；(4)在脐带组织片靠表皮一侧，固定脐带组织片靠表皮一侧，用镊子撕下脐带内侧整齐的组织层即羊膜下层组织，剩下薄薄一层透明的脐带表皮即羊膜层组织；(5)将羊膜下层组织用剪刀剪成约1cm2的组织片，将靠近表皮侧贴在培养皿中整齐排开；(6)不加培养液，直接放置于5％CO2、38.5℃培养箱内，静置一小时后，倒置两小时；(7)然后加入细胞培养液5mL，置于5％CO2、37℃培养箱内继续培养，当组织片周围的细胞达到80％融合时，将培养皿从培养箱内取出；(8)胰酶消化：先用磷酸盐缓冲液清洗培养皿两次，吸弃洗液，吸取含0.25％胰酶和0.1％EDTA的磷酸盐缓冲液，加入到培养皿内，消化3‑5分钟，再将细胞培养液加入到培养皿中，反复吹打，使脐带组织间充质干细胞进入消化液中；(9)将消化液经100目灭菌滤网过滤，去掉脐带组织片，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；(10)将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，重新悬浮细胞，获得脐带组织间充质干细胞；其中步骤(1)所述磷酸盐缓冲液的组成如下：8g/L的NaCl，0.2g/L的KCl，1.15g/L的Na2HPO4，0.2g/L的KH2PO4，pH为7.4；还含青霉素和链霉素，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml。