[发明专利]一种高效生产L‑谷氨酸氧化酶的方法

摘要

本发明公开了一种高效生产L‑谷氨酸氧化酶的方法，属于发酵工程和酶工程技术领域。本发明方法中L‑谷氨酸氧化酶重组菌最优诱导条件25‑30℃，乳糖5g/L诱导5h；通过分批补料发酵不同的补料方式研究，发现采用指数补料和DO‑stat相结合的方式有利于菌体密度的增加；通过对分批发酵的诱导条件优化，发现最佳诱导条件为对数期OD600＝40、10g/L乳糖诱导12h，酶活最高达到156.1U/mL；将高表达重组湿菌体添加到含有110g/L的谷氨酸pH8.0的缓冲液中，37℃转化24h可以生产107.9g/L的α‑酮戊二酸，转化率达到90％以上，所需菌液量仅为摇瓶发酵的1/50。

主权项

一种高效表达L‑谷氨酸氧化酶的方法，其特征在于，所述方法是以表达L‑谷氨酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，在发酵罐上进行分批补料培养生产L‑谷氨酸氧化酶；所述分批补料培养是指在分批发酵过程中，采用指数补料和DO‑stat两种补料方式相结合的策略进行补料培养；所述指数补料和DO‑stat两种补料方式相结合的策略是指在分批发酵过程中，当DO突然上升时开始采用比生长速率0.15‑0.45h‑1进行指数补料，指数补料过程中维持DO不低于20％，当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO‑stat并控制溶氧不高于设定的参数值，当菌体OD600达到30‑60时采用乳糖进行诱导；所述DO‑stat设定的参数值为20％‑30％中的任意一个值；所述方法具体是：(1)将重组大肠杆菌种子液按照3‑6％的接种量接入发酵罐中，控制温度35‑40℃，转速300‑500rpm，通气量1‑3vvm，补料前控制DO在30％以上；(2)指数补料培养阶段：当DO突然上升时开始采用比生长速率0.15‑0.45h‑1进行指数补料，指数补料过程中维持DO高于20％；(3)DO‑stat补料阶段：当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO‑stat并控制溶氧不高于设定的参数值；(4)诱导培养阶段：当菌体OD600达到30‑60时，采用终浓度为5g/L‑15g/L的乳糖进行诱导；所述DO‑stat设定的参数值为20％‑30％中的任意一个值；所述重组大肠杆菌为以E.coli BL21为宿主，以pET28a为表达载体，表达来源于Streptomyces ghanaensis ATCC14672的L‑谷氨酸氧化酶。