[发明专利]一种基于单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的特异性双抗体夹心法

摘要

一种基于单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的特异性双抗体夹心法，属于免疫分析领域。本发明用高碘酸钠法将光滑型鼠伤寒沙门氏菌LPS偶联牛血清白蛋白免疫7周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合、筛选得12株特异性识别沙门氏菌属的LPS单克隆抗体。12株抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP并以甲型副伤寒沙门氏菌菌体进行两两配对。以8G3作为包被抗体，8G3-HRP作为检测抗体，建立检测沙门氏菌属特异性双抗体夹心法，检测甲型副伤寒沙门氏菌LOD为10^⁶CFU/mL。本方法与沙门氏菌属内的菌均有交叉反应，而与E.coli、E.coli O157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，为食品中沙门氏菌属的检测提供了全面、可靠、快速高效的分析手段。

主权项

一种基于单克隆抗体的检测食品中沙门氏菌属的特异性双抗体夹心法，其特征在于酶标板上包被了包被抗体8G3，可特异性捕获沙门氏菌属内的沙门氏菌，包被抗体8G3与沙门氏菌结合后催化底物在450nm产生吸收值，P/N≥2.1时被判定为阳性，反之，P/N＜2.1则判定为阴性；抗体8G3，即细胞株O，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.9804；步骤为：（1）沙门氏菌属交叉型LPS单克隆抗体细胞株的制备用合成的沙门氏菌LPS‑BSA人工抗原为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选采用不同血清群的沙门氏菌和Ra LPS测试细胞株的交叉反应并挑选具有较强交叉反应的细胞进行亚克隆，最终得到了12株交叉型的沙门氏菌属特异性单克隆抗体；（2）单克隆抗体的配对筛选12株沙门氏菌属特异性单克隆抗体纯化后分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体8G3 4μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度5×10^7CFU/mL；标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS；检测抗体8G3‑HRP稀释1000倍使用，在此条件下，实验成功得到了10对P/N>5的配对；（3）沙门氏菌属特异性ELISA方法的建立选择检测限稳定、灵敏的配对，用包被抗体8G3和检测抗体8G3‑HRP建立了沙门氏菌属特异性的夹心ELISA分析方法；具体参数如下：包被抗体8G3包被浓度：4μg/mL，包被液：pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液，标品稀释液：含3.3mM EDTA 的pH7.2、0.01M的Tris‑HCl溶液，检测抗体浓度：2μg/mL，反应时间：包被、封闭：37℃，2h；标准品：37℃，1h；检测抗体37℃，1h；显色10min；该ELISA对沙门氏菌属内的甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、汤普逊沙门氏菌、布洛克利沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌均有交叉反应，对应的检测限P/N≥2.1，分别为：1.5×10^6CFU/mL、1.5×10^6CFU/mL、6.3×10^6CFU/mL、1.3×10^7CFU/mL、3.1×10^6CFU/mL、3.1×10^6CFU/mL、6.3×10^6CFU/mL、6.3×10^6CFU/mL、2.5×10^7CFU/mL、2.5×10^7CFU/mL、6.3×10^6CFU/mL、2.5×10^7CFU/mL；与E.coli、E.coli O157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应。