[发明专利]一种以叶片为外植体的红马银花组织培养方法

摘要

本发明公开一种以叶片为外植体的红马银花组织培养方法。该方法包括外植体的采集和预处理、灭菌和接种、愈伤组织诱导培养、芽诱导培养、继代培养、炼苗和移栽。本发明方法能够促使红马银花愈伤组织顺利生根，其组培苗生根率达到80％以上，根长苗壮，移栽成活率达到90％以上。

主权项

一种以叶片为外植体的红马银花组织培养方法，包括如下步骤：(1)外植体的采集和预处理采集无病虫害的野生红马银花带叶茎段，清水冲洗，在茎段上切取叶片；(2)灭菌和接种将清洗干净的红马银花叶片在超净工作台上按下列顺序进行灭菌：质量分数为0.1％HgCl2溶液中消毒5min，无菌水清洗4‑5次，质量分数为2％NaClO溶液中灭菌5min，无菌水清洗4‑5次，无菌滤纸吸干表面水分，然后将叶片切成0.8‑1.0cm长的片段，接种在基础培养基上，所述基础培养基为：WPM+蔗糖20‑30g/L+琼脂5‑8g/L，pH 5.3‑5.5；(3)愈伤组织诱导培养将步骤(2)接种的叶片转接到叶片愈伤组织培养基中，在温度25℃±2℃，暗培养至有愈伤组织出现，所述叶片愈伤组织培养基：WPM+6‑BA 1.8‑2.2mg/L+2,4‑D 2.8‑3.2mg/L，pH 5.3‑5.5；(4)芽诱导培养将步骤(3)形成的愈伤组织接种到芽诱导和继代培养基中，在光照强度1400‑1800Lx、光照时间12h/d、温度25±2℃的条件下培养诱导形成丛生芽，所述芽诱导和继代培养基为：WPM+ZT 0.8‑1.2mg/L+NAA 0.05mg/L+AC 0.5g/L，pH 5.3‑5.5；(5)继代培养将步骤(4)诱导形成的丛生芽每隔60‑80d按步骤(4)所述的方法进行继代培养；(6)生根培养将步骤(5)继代培养的丛生芽分株转接到生根培养基中，在25±2℃，光强1600‑2200Lx，光照时间12‑14h/d条件下培养至基部长出3‑6条根系即成红马银花组培苗，所述生根培养基为：WPM+IBA 0.8‑1.2mg/L+NAA 0.4‑0.6mg/L+AC1g/L，pH 5.3‑5.5；(7)组培苗的炼苗和移栽①炼苗：将根长为6‑10cm,根数量≥6根的组培苗带瓶移至大棚内，放置2‑4天后打开瓶盖，在24‑28℃，空气相对湿度75‑90％，光强6500‑8000Lx条件下炼苗4‑6天；②移栽与培养：将炼苗后的组培苗洗净根部培养基，用质量分数为0.1‑0.15％的多菌灵百菌清溶液浸泡根部40‑80秒后，移栽至沙壤土∶腐殖土按体积6:4的混合基质中，用塑料薄膜覆盖保温保湿，温度保持在28‑30℃，空气相对湿度85‑95％，于6000Lx条件下培育8‑10d即成红马银花种苗。