[发明专利]一种对生产二十二碳六烯酸隐甲藻进行基因转化的方法

摘要

本发明公开了一种生产二十二碳六烯酸隐甲藻敏感的抗生素潮霉素B，以及利用潮霉素B做为抗性筛选标记，对隐甲藻进行基因转化的方法；该方法包括下述步骤：（1）隐甲藻敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定；（2）基因转化系统的建立；（3）外源基因片段的准备；（4）外源基因片段对隐甲藻的转化。利用本发明可以将外源基因导入隐甲藻细胞中，同时使用潮霉素B作为筛选标记，得到外源基因转化入隐甲藻后的工程菌株。该方法为开展隐甲藻的基因工程改造提供了重要的技术基础。

主权项

1.一种对隐甲藻进行基因转化的方法，其特征是包含如下步骤：（1）隐甲藻敏感抗生素潮霉素B作用浓度的确定：①培养基的配制：在C9N2培养基中对潮霉素B设置浓度梯度，10 mg/L‑ 50 mg/L；②潮霉素B敏感浓度的确定：隐甲藻在25℃，180 rpm条件下振荡培养48 h，取50 μL细胞悬浮液均匀涂布在5个梯度平板上，25℃倒置培养2周 ，无抗平板培养作为阳性对照，最终确定隐甲藻对潮霉素B敏感浓度为40 mg/L；（2）转化体系的建立：①隐甲藻感受态细胞的制备：取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10 mL， 4℃，3500 rpm离心5 min，弃上清，加入1 mL 25 mM DTT溶液，30℃水浴15 min，离心5 min，弃上清，10 mL 1 M 山梨糖醇（sorbitol）清洗细胞三次，1 mL 山梨糖醇重悬细胞备用；②70 kDa荧光标记大分子FITC‑Dextran的转化：在无菌条件下取200 μL 隐甲藻感受态细胞于2 μm电极杯中，加入1 μL 鲑鱼精DNA和2 μg FITC‑Dextran 混匀，冰浴5 min，其中不加入FITC‑Dextran的作为阴性对照，加入FITC‑Dextran但不电击的作为阳性对照，设置电压1.4 kV，1.6 kV ，1.8 kV ，2.0 kV ，2.2 kV 和2.4 kV，电阻200 Ω，电容25和50 μF进行电击转化，电击结束之后在冰上冰浴5 min，用2 mL C9N2培养基重悬细胞并加入胰蛋白酶37℃培养30 min，荧光显微镜镜检细胞，观察是否有发绿色荧光的细胞，荧光分光光度计测定转化之后细胞悬浮液的荧光值；通过比较细胞悬浮液之间荧光值的差异最终确定电击转化条件为电压2.0 kV，电阻200 Ω，电容25 μF；（3）外源基因片段的准备：①隐甲藻18S上游引物片段的扩增：取隐甲藻基因组溶液10 ng，5×Phusion HF buffer 4μL，10 μM的dNTP 0.4 μL，10 μM上游引物 1 μL、10 μM 下游引物 1 μL ，Phusion酶0.2 μL，无菌水12.4 μL，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，4℃ 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的上游片段；②隐甲藻18S下游引物片段的扩增：取隐甲藻基因组溶液10 ng，5×Phusion HF buffer 4μL，10μM的dNTP 0.4 μL，10 μM上游引物1 μL、10 μM下游引物1 μL，Phusion酶0.2 μL，无菌水12.4 μL，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，4℃ 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻18S的下游引物片段；③潮霉素抗性基因（Hpt）的扩增，取pCAMBIA1301植物表达载体溶液10 ng，5×Phusion HF buffer 4 μL，10 μM的dNTP 0.4 μL，10 μM上游引物1 μL、10 μM下游引物1 μL，Phusion酶0.2 μL，无菌水12.4 μL，在PCR管中混匀；将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共30个循环，4℃ 5 min，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；④用于同源双交换整合的基因片段的构建：取已获得的隐甲藻18S上游引物片段、18S下游引物片段、以及Hpt片段各10 ng为模板，5×Phusion HF buffer 4 μL，10 μM的dNTP 0.4 μL，Phusion酶0.2 μL，无菌水10.4 μL，以10 μM 上游引物 1 μL、10 μM 下游引物 1 μL，在PCR管中混匀，将PCR管放入PCR仪中进行扩增循环，扩增程序为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，60℃ 90 s，72℃ 30 s，共30个循环，4℃ 5 min；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的上游引物片段、潮霉素B抗性片段、下游引物片段融合PCR产物；（4）外源目的基因片段对隐甲藻的转化；①隐甲藻感受态细胞的制备：取隐甲藻悬浮培养48 h的细胞10 mL， 4℃，3500 rpm离心5 min，弃上清，加入1 mL 25 mM DTT溶液，30℃水浴15 min，离心5 min，弃上清，10 mL 1 M 山梨糖醇（sorbitol）清洗细胞三次，1 mL 山梨糖醇重悬细胞备用；②外源目的基因片段的转化：在无菌条件下取200 μL 隐甲藻感受态细胞于2 μm电极杯中，加入1 μL 鲑鱼精DNA和2 μg 目的片段混匀，冰浴5 min，电击转化条件为2.0 kV，电阻200 Ω，电容25 μF，电击之后冰浴5 min，加入2 mL新鲜C9N2培养基25℃，180 rpm震荡复苏48 h，取50 μL细胞悬浮液均匀涂在含有40 mg/L潮霉素B的C9N2固体平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养，并对转化子进行确定；所述C9N2培养基为葡萄糖9 g，酵母浸粉2 g，海盐25 g，加水至1 L 。