[发明专利]一种鹿茸生物反应器的构建方法

摘要

本发明公开了一种鹿茸生物反应器的构建方法，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法为制备含有外源基因的慢病毒颗粒，将慢病毒颗粒结合磁性载体后感染生茸区骨膜，检测标记基因或外源基因的表达情况，获得鹿茸生物反应器。本发明可以人为改造鹿茸中有益成分，提高鹿茸中软骨成分的含量，提高鹿茸蜡片产量，提高鹿茸的附加值促进农户增收；还可以提高鹿茸中某种有益成分的含量；本发明生成的鹿茸生物反应器，可以随着鹿茸每年周期性再生，重复获取，即一次改造终身有效；本发明对鹿个体改造仅局限于决定鹿茸生成的骨膜组织，外源基因仅表达与后生的鹿茸组织中，更符合动物伦理要求。本发明适用于构建鹿茸生物反应器。 1

主权项

1.一种鹿茸生物反应器的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1）以质粒pLVTHM为出发质粒，构建含有外源基因的质粒，提取含有外源基因的质粒pLVTHM、质粒pCMV‑dr8.91和质粒pMD2.G的DNA，将DNA与转染试剂混合共转染包装细胞制备慢病毒颗粒，测定慢病毒颗粒的滴度；所述质粒质量之比为含有外源基因的pLVTHM： pCMV‑dr8.91：pMD2.G=2：1.5：0.75；

2）将含有磁性载体的PBS溶液与步骤1）获得的慢病毒颗粒混合，制备磁性载体偶联的慢病毒载体，作为病毒液；所述慢病毒颗粒的滴度为1×10⁸TU/mL；所述磁性载体为ViroMag R\L；

3）将步骤2）所得病毒液注射到生茸区骨膜与骨质之间，磁板覆盖在注射位置，静置30min，将目标基因导入骨膜干细胞，一周后重复操作，重复操作3次；

4）当生茸区发育到5~8cm高时，麻醉鹿后取下两侧茸尖，检测标记基因或外源基因的表达情况，获得鹿茸生物反应器。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述包装细胞，为293t细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述转染试剂，为Lipofectamine 2000；所述DNA和转染试剂，用无血清Opti‑MEM进行稀释；所述转染，是在37℃，5% CO2孵箱中进行。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述测定慢病毒颗粒的滴度，是利用梯度稀释法进行测定。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述标记基因，是位于质粒pLVTHM上的GFP基因。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤为：

1）以质粒pLVTHM为出发质粒，构建含有外源基因的质粒，提取含有外源基因的质粒pLVTHM、质粒pCMV‑dr8.91和质粒pMD2.G的DNA，将经过无血清Opti‑MEM稀释的DNA和Lipofectamine 2000室温孵育5 min后混合，混合液在室温孵育30 min；所述质粒质量比为含有外源基因的pLVTHM：pCMV‑dr8.91：pMD2.G= 2：1.5：0.75；

2）将步骤1）所得混合液与293t细胞置于已用多聚赖氨酸包被的培养皿中，在37℃，5% CO2的孵箱中进行共转染，获得浓缩病毒液，‑80℃或液氮保存；

3）将293t细胞消化并计数后稀释，加入96孔板中孵箱培养，12h后利用梯度稀释法进行测定滴度；

4）将PBS和磁性载体ViroMag R\L混合后冰上孵育，加入滴度为1×10⁸TU/mL的慢病毒颗粒，冰上孵育制备磁性载体偶联的慢病毒载体，作为病毒液；

5）将步骤4）所得病毒液注射到生茸区骨膜与骨质之间，磁板覆盖在注射位置，静置30min，缝合伤口后解除麻醉；一周后重复操作，共重复3次；

6）每隔两周进行观测，生茸区发育到5~8 cm高时，麻醉实验鹿取下两侧茸尖，制备组织切片，检测外源基因的表达情况，获得鹿茸生物反应器。