[发明专利]一种检测口含烟制品细胞毒性的试验方法

摘要

本发明提供一种检测口含烟制品细胞毒性的试验方法，经过样品前处理、单细胞悬液的制备、细胞浓度计算、细胞接种、加入受试物、孵育受试物、染料孵育、测定吸光值、计算细胞抑制率、计算半数细胞致死剂量等步骤。本发明综合考察口含烟制品的暴露途径、作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法，根据口含烟制品作用靶细胞选取了人口腔粘膜成纤维细胞hOMF作为口含烟制品细胞毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合口含烟制品的细胞毒性试验检测方法。

主权项

一种检测口含烟制品细胞毒性的试验方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）样品前处理方法：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37℃下静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；（2）单细胞悬液的制备：将人口腔粘膜成纤维细胞hOMF细胞于37℃、5%CO2、95%RH培养箱中培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1～2mL浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，再加入DMEM/F12细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；（3）单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；（4）细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用DMEM/F12细胞培养基稀释至1.0～1.5×105个/mL，再按接种量为200μL/孔，接种到96孔细胞培养板中，将96孔细胞培养板置于37℃、5%CO2、95%RH培养箱内培养24h；（5）受试物分为四组：空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；空白对照组和细胞对照组加DMEM/F12细胞培养基；阳性对照组加1400μg/mL的十二烷基硫酸钠溶液；检测样品组加不同剂量的步骤（1）所得待测液；（6）剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置9个非零剂量：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL、1200μg/mL、1400μg/mL；（7）加入受试物：移除步骤（4）中96孔细胞培养板内的培养基，再按步骤（5）进行分组，在空白对照组和细胞对照组相应的孔内加入DMEM/F12细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加1400μg/mL的十二烷基硫酸钠溶液；在检测样品组相应的孔内加入步骤（1）所得待测液，使终浓度分别为步骤（6）设定的剂量；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为200μl/孔；（8）孵育受试物：将步骤（7）加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5%CO2、95%RH（空气相对湿度）培养箱中孵育24h；（9）染料孵育：方案1采用中性红法：在步骤（8）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组去除细胞培养基，加入浓度为100μg/mL的中性红溶液200μL/孔，再置于37℃、5%CO2、95%RH培养箱中孵育4h后移除中性红溶液，加入浓度为1%（v/v）的甲醛溶液200μL/孔固定1min后移除甲醛溶液，加入中性红萃取液200μL/孔，置于微板振荡器内振荡10min；或者，方案2采用MTT法：在步骤（8）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组中加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL/孔，再置于37℃、5%CO2、95%RH培养箱中孵育4h后移除96孔培养板中溶液，加入DMSO溶液200μL/孔，置于微板振荡器内振荡10min；（10）测定吸光值：将步骤（9）处理后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组，用酶标仪在540nm或490nm波长下检测吸光值；（11）计算细胞抑制率：根据步骤（10）所得吸光值，按照下列公式计算细胞抑制率：式中：X——细胞抑制率；ODn——步骤（10）所得检测样品组多孔平均的吸光值；ODo——步骤（10）所得空白对照组多孔平均的吸光值；ODc——步骤（10）所得细胞对照组多孔平均的吸光值；（12）计算半数细胞致死剂量：根据9个非零剂量对应的细胞抑制率绘制曲线，再进而通过SPSS软件计算IC50。