[发明专利]口含烟制品细菌回复突变的检测方法

摘要

本发明提供一种口含烟制品细菌回复突变的检测方法，经过样品前处理方法、增菌培养、受试菌浓度确定、平板掺入、结果判定等步骤。本发明综合考察口含烟制品的暴露途径，作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法并制定了样品检测剂量，形成了适合口含烟制品的细菌回复突变试验检测方法。

主权项

一种口含烟制品细菌回复突变的检测方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）样品前处理方法：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL人工唾液，于37℃下静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；（2）增菌培养：取无菌营养肉汤培养基，加入无菌小三角瓶中，将主平板或冷冻保存的TA98和TA100菌株分别接种于营养肉汤培养基内，于37℃下振荡培养10h或静置培养16h，得菌液；（3）受试菌浓度确定：用紫外分光光度计测定步骤（2）的菌液在600nm下的OD值，再用无菌营养肉汤培养基将菌液稀释至其OD值为0.3，得到检测用菌液；（4）受试样品组剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置4个非零剂量：6.25μg/皿、12.5μg/皿、25μg/皿、50μg/皿；（5）阳性对照、自发回变组和溶剂对照的设定：阳性组：选择2‑氨基芴作为TA98的阳性物，剂量为2μg/皿；选择叠氮钠作为TA100的阳性物，剂量为1μg/皿；自发回变组：加入步骤（3）的检测用菌液0.1mL；溶剂对照组：加入人工唾液，剂量为5μL/皿；（6）S9混合液的配制：按照GB15193.4‑2003食品安全性毒理学评价程序和方法中鼠伤寒沙门氏菌试验标准进行制备浓度为10%（V/V）的S9混合液备用；（7）平板掺入：将步骤（3）的检测用菌液0.1mL和步骤（6）所得浓度为10%（V/V）的S9混合液0.5 mL混合，分别加入步骤（4）中四种浓度的步骤（1）所得待测液 0.1 mL，再加入2.0mL 37℃保温的顶层培养基，再混匀后迅速倒入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层培养基上，平放固化，置于37℃恒温培养箱中培养48h，作为受试样品检测组；步骤（5）中的阳性组、未处理组、溶剂对照组均按本步骤操作；（8）结果判定：观察步骤（7）的培养基，分别计数阳性对照、自发回变组、溶剂对照和受试样品组培养基上长出的回复突变菌落数，受试样品组诱发的回变菌落数等于或大于自发回变组回复突变菌落数的2倍以上，并有剂量效应关系，即可认为该受试物诱变试验为阳性，反之为阴性。