[发明专利]一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法

摘要

本发明提供了一种斑马鱼原代胚胎细胞体外分化为心肌细胞的新方法。斑马鱼交配后收集发育至囊胚期的胚胎，经消毒及去绒膜处理后，吹打成单个细胞，再置于明胶包被过的细胞培养容器中用心肌细胞诱导培养液培养24至48小时后得到能自发收缩的心肌细胞。心肌细胞诱导培养液组分为Leibovitz L‑15培养基、Dulbecco改良Eagle培养基、Ham's F12培养基、胎牛血清、鱼血清、斑马鱼胚胎粗提物、胰岛素、青霉素和链霉素。通过本发明每诱导1万个原代胚胎细胞可获得200个以上的心肌细胞团，且能保持自发收缩特性20天。本发明可实现经济、快速且高效地筛选对心肌细胞形成和发育有影响的生物大分子或小分子药物。

主权项

一种斑马鱼胚胎细胞体外分化为心肌细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)斑马鱼雌、雄个体交配后收集胚胎，放入水中置于培养箱内培养至囊胚期；(2)囊胚期的胚胎经次氯酸钠除菌后用E2溶液清洗后，再用链霉蛋白酶处理去除绒膜；(3)去除绒膜的胚胎用E2溶液清洗后，用胚胎细胞培养液吹打成单个细胞；(4)离心弃去上清，再用胚胎细胞培养液清洗；(5)离心弃去上清，加入不含胎牛血清和草鱼血清的心肌细胞诱导培养液再悬浮细胞，将细胞悬液加入到明胶包被过的细胞培养容器，置于培养箱内培养，0.5～1小时后加入相应体积比的胎牛血清和草鱼血清继续培养，24～48小时后得到心肌细胞；所述的心肌细胞诱导培养液的组分和配比如下：Leibovitz L‑15培养基40.5％(v/v)、Dulbecco改良Eagle培养基28.35％(v/v)、Ham's F12培养基12.15％(v/v)、胎牛血清15％(v/v)、草鱼血清1％(v/v)、蛋白浓度5mg/mL的斑马鱼胚胎粗提物1％(v/v)、5mg/mL胰岛素1％(v/v)，青霉素链霉素溶液1％(v/v)；所述的E2溶液的组分和浓度如下：7.5mM NaCl、0.25mM KCl、0.5mM MgSO4、0.075mM KH2PO4、0.025mM Na2HPO4、0.5mM CaCl2、0.35mM NaHCO3；所述的胚胎细胞培养液的组分和配比如下：Leibovitz L‑15培养基42％(v/v)、Dulbecco改良Eagle培养基29.4％(v/v)、Ham's F12培养基12.6％(v/v)、胎牛血清15％(v/v)、青霉素链霉素溶液1％(v/v)，所述的青霉素链霉素溶液中青霉素、链霉素的浓度分别为10000IU/mL、10mg/mL；所述的斑马鱼胚胎粗提物通过包含如下步骤的方法制备：取受精1～3天的斑马鱼幼鱼，用匀浆器研磨后，离心取上清，过滤；所述的草鱼血清通过包含如下步骤的方法制备：选取性成熟前的草鱼，抽取其血液，静止收集血清，离心取上清，过滤。