[发明专利]一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌及构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌及构建方法及应用，构建方法为将橙色绿曲挠菌中丙二酰辅酶A还原酶基因克隆进入集胞藻6803，并将集胞藻6803中乙酰辅酶A羧化酶、生物素酰化酶以及NAD(P)转氢酶基因进行过表达，本发明通过合成生物学方法改造集胞藻6803，得到一种产三羟基丙酸集胞藻6803基因工程菌，实验证明，本发明的基因工程菌最终3‑HP产量达到837.18mg/L，这对光合微生物生产3‑HP具有重要的理论及实际意义。

主权项

一种产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：1)以序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.9为上、下游引物以橙色绿曲挠菌基因组为模板，通过PCR扩增得到丙二酰辅酶A还原酶基因mcr，所述基因mcr的序列为SEQ ID No.17所示，以SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示序列分别为上游引物，以SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示序列分别为下游引物，以集胞藻6803基因组为模板PCR扩增得到PntA，PntB，AccA，AccB，AccC，AccD和BirA基因并依次用SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24所示；2)将步骤1)中得到的基因mcr与pZTS质粒用限制性内切酶BamHI和NotI进行消化，将pntA基因用限制性内切酶KpnI和NotI进行消化，将pntB基因用限制性内切酶KpnI和XhoI进行消化，并依次插入到表达载体pTZS中得到pTZS‑MP载体；将accB基因用限制性内切酶EcoRI和SacI进行消化，将accC基因用限制性内切酶KpnI和SacI进行消化，将accA基因用限制性内切酶XhoI和KpnI进行消化，将accD基因用限制性内切酶XhoI和NotI进行消化，将birA基因用限制性内切酶NotI和SmaI进行消化，并依次连入pJA2表达载体中得到pJA‑ACC载体；3)将pTZS‑MP载体转入集胞藻6803中，涂布含10μg/mL的氯霉素BG11平板培养基，挑取阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到重组集胞藻6803工程菌命名为SMP；将pJA‑ACC载体转入重组集胞藻6803工程菌SMP中，涂布于含10μg/mL的卡那霉素BG11平板培养基，挑取阳性转化子，并进行分子鉴定阳性克隆，筛选阳性克隆，得到产三羟基丙酸的集胞藻6803基因工程菌命名为SMPA。