[发明专利]金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法、蛋白酶及其应用

摘要

本发明公开了金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法、蛋白酶及其应用，包括对新鲜金鲳鱼的内脏脱脂、浸提、离心后得到蛋白酶粗酶液，然后采用硫酸铵对蛋白酶粗酶液进行粗分离得到复合蛋白酶液，最后采用SephadexG‑100凝胶分离步骤2得到的复合蛋白酶液得到三种不同的蛋白酶，记为蛋白酶组分1、蛋白酶组分2、蛋白酶组分3。本发明方法充分利用金鲳鱼加工过程中的生产残渣，在金鲳鱼内脏中提取到了明胶降解能力强且专一的蛋白酶，为分解明胶的蛋白酶提取开辟了新的途径，提高额金鲳鱼的利用率，实现了金鲳鱼的高附加值利用。此外，本发明方法原料成本低，生产工艺简单。

主权项

金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法，其特征在于，按以下步骤进行：步骤1：对新鲜金鲳鱼的内脏脱脂、浸提、离心后得到蛋白酶粗酶液：将洗干净的新鲜金鲳鱼的内脏切成段，按照固液体积比1:2‑3的比例将内脏放在4℃的丙酮中脱脂10‑20min，去除脂肪，脱脂结束后用4℃的蒸馏水洗干净内脏上的丙酮；然后将脱脂后的内脏加入到3‑5倍体积的4℃的pH＝7.5的Tris‑HCl缓冲溶液中，用打浆机将其充分打碎后在4℃条件下浸提2‑5小时；最后在4℃，10000‑20000rpm下离心15‑30min，取上清液，上清液即为蛋白酶粗酶液；步骤2：采用硫酸铵对蛋白酶粗酶液进行粗分离得到复合蛋白酶液：2.1，首先将硫酸铵研磨成细粉末，分别加入到蛋白酶粗酶液中至以下质量分数：25％、35％、45％、55％、65％，盐析得到粗复合蛋白酶液；2.2，然后以酪蛋白为标准底物，利用紫外分光光度法测定不同硫酸铵质量分数下盐析得到的粗复合蛋白酶液的酶活性，选取活性最高的粗复合蛋白酶液；2.3，将步骤2.2得到的活性最高的粗复合蛋白酶液在4℃条件下静置2‑5小时，然后于4℃、10000‑15000r/min下离心10‑20min，丢弃上清液，沉淀用1/5‑1/4蛋白酶粗酶液体积的pH7.5的Tris‑Hcl缓冲溶液溶解，然后在4℃条件下，以蒸馏水为透析外液在磁力搅拌下透析24‑48h，期间换蒸馏水多次，透析袋中的液体即为复合蛋白酶液；步骤3：采用SephadexG‑100凝胶分离步骤2得到的复合蛋白酶液，得到三种不同的蛋白酶，根据出峰时间依次记为：蛋白酶组分1、蛋白酶组分2、蛋白酶组分3：将复合蛋白酶液用SephadexG‑100凝胶进行分离，分别收集每个峰的洗脱组分，得到三种不同的蛋白酶，分别用透过分子量为8000道尔顿‑14000道尔顿的透析袋，对三种不同的蛋白酶透析，得到最终的蛋白酶组分1、蛋白酶组分2、蛋白酶组分3；其中，SephadexG‑100凝胶分离条件为：样品浓度5‑20mg/mL，上样量为1‑2mL，蒸馏水为洗脱液，洗脱流速为1.5‑2.0mL/min，检测波长为280nm。