[发明专利]人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法

摘要

本发明公开了一种人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法，主要步骤包括：成人乳汁的采集；获取和分离人乳干细胞；培养人乳干细胞；检测、冻存人乳干细胞；建库。利用本发明的获取人乳干细胞的方法，可有效的分离、纯化、扩增人乳干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并建立长期储存人乳干细胞的干细胞库以便向临床及科研应用提供大量的干细胞资源。根据本发明的方法获取的人乳干细胞构建干细胞库，其来源丰富，细胞获取简便，该库为健康成人储存人乳干细胞，为其本人在患病需要采用干细胞治疗时，提供临床适用型脂肪干细胞，并且可以在取得许可后，将所储存的人乳干细胞用于干细胞制剂的生产。

主权项

一种人乳干细胞库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）人乳汁的采集：采集乳汁之前，采集供者的可确认身份的信息，并对供者进行至少ABO/Rh血型的检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；（2）获取和分离人乳干细胞：将采集的乳汁在无菌条件下加入营养液稀释，之后在转速为250‑800 g下离心10‑20min，去除上层的油脂和乳状液体，底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养装置中，在37℃、5%CO₂的条件下培养，每2‑3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至密度为80‑90%时即得到原代人乳干细胞；（3）人乳干细胞的培养：将获得的原代人乳干细胞以0.1×10⁵‑1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种在细胞培养装置中，待细胞长满后，去除旧培养液，用平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后使用0.25%消化液消化，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落或在显微镜下观察到细胞之间分离，立刻加干细胞培养液终止消化，轻柔吹打成单细胞；之后800‑1000rpm离心5‑6分钟，弃上清，加干细胞培养液进行轻柔吹打；将细胞悬液1:4传到细胞培养装置中，每个装置加入干细胞培养液进行培养，期间不用换液，以获得更多的人乳干细胞；（4）人乳干细胞的检测与冻存：人乳干细胞的检测：待人乳干细胞长至密度为80‑90%融合时，去除之前的培养液，用平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，接着加入0.25%‑0.5%含EDTA的胰酶，在37℃条件下消化3‑5分钟，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化；将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800‑1000rpm离心5‑6分钟，结束后去除上清，收获得到人乳干细胞；将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，所述质量检测包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测，以确定细胞是否达到合格标准，其余同批次所得人乳干细胞进行细胞冻存；人乳干细胞的冻存：将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为1×10⁶~1×10⁷个/mL，分装入冻存容器中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到‑196℃的液氮中长期保存；细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测；其中，人乳干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后由专门人员进行处理；（5）建库：在储存入库的容器载体上建立人乳干细胞的信息，将前述所采集的供者的可确认身份的信息和相应人乳干细胞制备及其细胞库构建过程的信息录入计算机数据库，并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实，纳入人乳干细胞库管理，即完成人乳干细胞库的构建。