[发明专利]一种异烟棒曲霉素C的制备方法

摘要

一种异烟棒曲霉素C的制备方法，步骤：1）复苏固体培养基的配制；2）液体发酵培养基的配制；3）菌种复苏；4）发酵培养；5）过滤、萃取；6）粗制；7）精制，即得异烟棒曲霉素C。其优点是：1、本发明的培养基(复苏固体培养基、液体发酵培养基的配制)简单易得、成本低；真菌生长速度快、孢子活力高；提高了工作效率；2、污染小、效率高、产率高、纯度高，可操作性强。具体为：采用二氯甲烷取代氯仿，洗脱剂毒性减小；粗制仅需三种体系洗脱剂，步骤大大简化，精制采用恒梯度以甲醇-水洗脱，操作简单，减少了样品损失，提高了制备效率；产率提高了约5倍，即由6.8μg/mL提高到33μg/mL；结合高效液相色谱制备，目标产物的纯度高达99.3%。

主权项

一种异烟棒曲霉素C的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1）复苏固体培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏1.5~1.8%、大豆蛋白胨0.15~0.35%、琼脂 1.8~2.3%，该培养基的初始pH值为5.5～6.0；在生物安全柜中，将经过灭菌后的复苏培养基在温度大于40℃时，倒入经过灭菌的培养皿中，自然冷却备用；2）液体发酵培养基的配制：每升水中下列各组分按重量百分比为：麦芽浸膏1.5~1.8%、大豆蛋白胨0.15~0.35%，该培养基的初始pH值为5.5～6.0；将该培养基倒入烧瓶中，封口、灭菌备用；3）菌种复苏: 取一定量的青霉菌Penicillium sp.Y32，将其接种到步骤1所述的复苏固体培养基上，放入25℃～30℃恒温培养箱中，培养一至两天；4）发酵培养：在生物安全柜中，将步骤3中在复苏固体培养基上培养出的菌种孢子，接种到步骤2 所述的含有液体培养基的烧瓶中，在温度为25℃～30℃恒温静置培养25‑35天；5）过滤、萃取：将步骤4所得的菌液与菌丝体进行过滤、分离；取菌液，用1~2倍体积的乙酸乙酯，超声萃取三次；取菌丝体，先用80%丙酮水溶液浸泡2～4小时，超声、机械破碎，过滤后的混合液蒸发掉丙酮后，采用1~2倍体积的乙酸乙酯超声萃取三次；合并两者的乙酸乙酯萃取物；6）粗制：将步骤5所得的乙酸乙酯萃取物进行浓缩，与100‑300目的硅胶拌样；将拌样硅胶加到3倍体积的300‑400目的硅胶柱层析上，依次使用二氯甲烷、60:1的二氯甲烷‑甲醇、30:1的二氯甲烷‑甲醇三种溶剂进行系统洗脱；将使用30:1的二氯甲烷‑甲醇所得的洗脱液进行收集，并浓缩至固态，得到粗品；7）精制：将上述粗品使用甲醇进行溶解、用滤膜过滤，滤液加载于高效液相色谱仪以一定的流速，进行分离纯化，洗脱溶剂使用80:20的甲醇‑水，从而得到异烟棒曲霉素C。