[发明专利]一种基于荧光PCR的快速核酸测序法

摘要

本发明涉及一种基于荧光PCR的快速核酸测序法，在细菌基因测序中成功应用，可用于病原菌鉴定。采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段，上机进行双脱氧测序。研制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂：1）FTA卡1片。2）PCR反应液1管，内装SYBR GREEN荧光PCR反应液。3）上下游引物各1管，内装目标序列扩增及测序引物。4）双脱氧测序试剂一套。5）测序产物纯化试剂一套，包括XTerminator solution、SAM solution各1管。6）去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水。由于采用FTA卡保存核酸，该卡自然晾干后，能在室温下长期保存，不仅方便保存，PCR扩增时无需进行核酸提取，而且避免了普通细菌基因测序时处理菌悬液操作过程的生物安全风险。

主权项

一种基于荧光PCR的快速核酸测序法，采用FTA卡核酸保存病原菌核酸、实时荧光PCR技术扩增目标片段，上机进行双脱氧测序；基于本发明研制的荧光PCR快速测序试剂套装包括下列试剂：1）FTA卡1片;2）PCR反应液1管，内装SYBR GREEN荧光PCR反应液，包括Taq酶、dNTP、含Mg²⁺的Buffer、SYBR GREEN溶液;上下游引物各1管，内装目标序列扩增及测序引物;双脱氧测序试剂一套，包括BigDye Terminator v3.1 Sequencing Buffer (5×), BigDye Mix;测序产物纯化试剂一套，包括XTerminator solution、SAM solution各1管;去离子水1管，内装无DNA酶的灭菌去离子水;基于本发明建立的基于荧光PCR的快速测序方法，按下列步骤进行：1）FTA样品卡的制备细菌悬液经适当稀释后（大约6×10⁴ 至6×10⁷ CFU/mL），吸取100ul滴于FTA卡上，室温晾干备用;2）SYBR Green实时荧光PCR直接扩增目标片段配制反应体系：按常规配制SYBR Green实时荧光PCR反应体系，加入上下游引物的终浓度均为100ng/uL，用打孔器在FTA卡打出直径0.5mm的纸片加入体系，终体积为20uL；荧光PCR直接扩增：使用荧光定量PCR仪进行扩增，扩增反应条件为，95℃ 2min，[95℃ 10s，60℃ 20S，72℃ 40S(荧光采集)] 35次循环，72℃ 10min；PCR扩增效果评价：Cp（或Ct）值小于30且熔解曲线显示有一个明显主峰，否则即为扩增产物不合格;3）测序PCR反应如果荧光PCR扩增产物合格，将PCR产物依据Cp值大小稀释5‑10倍，取已稀释的产物1ul置于PCR管中，再加4ul BigDye Terminator v3.1 Sequencing Buffer (5×), 测序引物（上游或下游引物）的终浓度为100ng/uL，终体积为10uL，使用梯度PCR仪进行扩增；扩增条件为：98℃ 2min ，（96℃ 10S， 50℃ 5s， 60℃ 4min）25次循环;4）产物纯化、毛细管电泳、序列读取和分析在96孔板中加入产物1uL，SAM solution 9uL，BigDye XTerminator solution 2uL；震荡5min，2000g 离心2min，盖上测序用硅胶封盖，用基因分析仪进行毛细管电泳，电泳完毕机器自动根据测序谱图并进行序列读取，可获得目标片段基因序列;方法原理：将FTA卡核酸保存技术、实时荧光PCR技术与传统双脱氧测序法创新性相结合，使双脱氧基因测序操作步骤有明显简化，减少工作量，但细菌测序质量基本不变；具体步骤包括：FTA卡保存细菌核酸，实时荧光PCR直接扩增后上机进行双脱氧测序；由于采用FTA卡保存核酸，该卡自然晾干后，能在室温下长期保存，不仅方便保存，PCR扩增时无需进行核酸提取，而且避免了普通细菌基因测序时处理菌悬液操作过程的生物安全风险；由于采用实时荧光PCR代替普通PCR，可以免去凝胶电泳的操作，不仅降低操作过程中样品或PCR反应体系的交叉污染，也可以实时监控PCR扩增的效果，同时还缩短了实验时间。