[发明专利]一种应用于毛细管凝胶电泳分析蛋白的内标指示物

摘要

本发明公开了应用于毛细管凝胶电泳分析蛋白的内标指示物以及采用该内标指示物测定蛋白样品的测定方法，该测定方法采用苯甲酸作为内标指示物，并采用还原法毛细管凝胶电泳法测定蛋白样品纯度；其蛋白优选为为抗VEGF单克隆抗体，且蛋白样品测定浓度范围为0.3‑2.0mg/ml，内标指示物苯甲酸的优选浓度为3mg/ml。本发明的能够彻底解决内标指示物批次间差异及影响待测样品纯度分析的准确性问题，同时不会引入新的杂质，稳定性好，且该内标指示物不易覆盖所分析的蛋白样品的样品片段信号、并能准确计算蛋白质样品的纯度，同时也避免了对风险杂质的误判。

主权项

1.一种毛细管凝胶电泳法测定蛋白样品纯度的方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：(1)配制蛋白样品‑缓冲液‑内标指示物溶液；(2)将含有蛋白样品‑缓冲液‑内标指示物溶液的离心管，置于70℃水浴10min，然后振荡混匀，采用3000rpm的转速离心60s，取上清液90μL至PCR管中，最后将具有上清液的PCR管装入毛细管电泳仪的进样瓶中，盖上进样瓶瓶盖，备用分析；(3)采用毛细管凝胶电泳法进样分析，获得吸光度‑时间图谱，通过积分面积计算获得所述蛋白样品的纯度；其中毛细管凝胶电泳法进样时，先依次采用0.1M的氢氧化钠冲洗毛细管电泳仪中的凝胶分离柱10min，0.1M的盐酸冲洗该凝胶分离柱1min，超纯水冲洗该凝胶分离柱1min，再电动进样待测蛋白样品；进样条件为：电动进样电压5kV×20s，分离电压为15kV×30min，紫外波长214nm检测，分离柱柱温25℃，所述蛋白样品‑缓冲液‑内标指示物溶液的配制，包括如下步骤：(a)配制质量‑体积百分比为0.3％g/ml的苯甲酸溶液：称取苯甲酸30.000mg，加水定容至10mL，于80℃水浴10min，混匀后，室温保存备用；(b)配制上样缓冲液：分别称取Tris 1.211g和SDS 1.000g，加水80mL溶解，混匀获得中间缓冲液；冷却后用浓HCl调节所述中间缓冲液的pH至8.8‑9.2，最后加水定容至100mL，混匀后室温保存备用；(c)配制β‑巯基乙醇与上样缓冲液的混合液：量取β‑巯基乙醇0.5mL与步骤(b)所述上样缓冲液5.5ml，混匀后获得所述β‑巯基乙醇与上样缓冲液的混合液；(d)蛋白样品的稀释：将蛋白样品用水稀释至2.5mg/mL，获得稀释的蛋白样品；(e)配制蛋白样品‑缓冲液：取40μL稀释的蛋白样品和60μLβ‑巯基乙醇与上样缓冲液的混合液，混合均匀备用；(f)配制蛋白样品‑缓冲液‑内标指示物溶液：在100μL蛋白样品‑缓冲液中加入2μL所述0.3％g/ml的苯甲酸溶液，制得所述蛋白样品‑缓冲液‑内标指示物溶液；其中，所述蛋白样品‑缓冲液‑内标指示物溶液中蛋白样品的浓度为1.0mg/ml，并且用于配制所述蛋白样品‑缓冲液‑内标指示物溶液的内标指示物苯甲酸的浓度为3mg/ml。