[发明专利]单克隆抗体的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤一，B细胞的获取、富集与纯化；步骤二，标记抗原与特异性B细胞的结合；步骤三，抗原特异性B细胞的获取；步骤四，扩增抗体可变区基因；步骤五，构建表达载体；步骤六，重组抗体表达与纯化：以纯化后的表达载体DNA转染对数生长期的293T细胞，离心除去细胞碎片，离心液采用蛋白G柱纯化，获得重组单克隆抗体溶液。本发明获得的重组单克隆抗体浓度升高显著，降低了成本，适合工业上的大规模生产应用。本发明获得的单克隆抗体能够特异性中和丙型肝炎E1抗原，可以用于制备预防和治疗丙型肝炎的药物。

主权项

一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，B细胞的获取、富集与纯化：从传染病患者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；步骤二，标记抗原与特异性B细胞的结合：将以荧光或生物素标记的传染病病原体抗原蛋白与步骤一中的B细胞进行特异性结合；步骤三，抗原特异性B细胞的获取：根据标记，以流式细胞仪筛选分离出上一步骤中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；步骤四，扩增抗体可变区基因：应用单细胞巢式RT‑PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；步骤五，构建表达载体：将上一步骤所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，再转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA；步骤六，重组抗体表达与纯化：以纯化后的表达载体DNA转染对数生长期的293T细胞，离心除去细胞碎片，离心液采用蛋白G柱纯化，装柱后用两轮PBS洗涤，用0.3‑0.45mol/L的柠檬酸钠溶液洗脱，获得重组抗体溶液，即可。