[发明专利]一种内含肽介导的对重组蛋白定点聚乙二醇修饰的方法

摘要

本发明公开了一种内含肽介导的对重组蛋白进行定点聚乙二醇修饰的方法，该方法包含1、合成重组蛋白基因片段；2、构建重组蛋白基因‑GyrA融合基因片段，并在GyrA基因C端加纯化标签，通过双酶切构建入表达载体中，并导入宿主细胞；3、发酵宿主细胞获得包含重组蛋白、内含肽和纯化标签的融合蛋白产物；4、在聚乙二醇(PEG)修饰物NH2‑PEG‑COOH的氨基端合成加入一个半胱氨酸(Cys)，得到PEG活化修饰物；5、纯化步骤3所得的融合蛋白产物，用切割液于4℃进行切割；6、加入PEG活化修饰物进行PEG修饰；7、纯化PEG修饰的重组蛋白。本发明制备的PEG修饰蛋白，成分均一，纯度高，活性损失小。

主权项

一种内含肽介导的对重组蛋白进行定点聚乙二醇修饰的方法，其特征在于，该方法包含：步骤1，克隆或合成重组蛋白基因片段；步骤2，将重组蛋白基因片段与Mxe GyrA内含肽基因片段用重叠PCR技术连接为重组蛋白基因‑GyrA融合基因片段，在GyrA基因C端加纯化标签，通过双酶切构建入表达载体中，并导入宿主细胞中进行表达；步骤3，发酵该宿主细胞，使其表达目的融合蛋白，获得包含重组蛋白、内含肽和纯化标签的融合蛋白产物；步骤4，在聚乙二醇(PEG)修饰物NH2‑PEG‑COOH的氨基端合成加入一个半胱氨酸Cys，进行高效液相色谱HPLC纯化，得到Cys‑PEG‑COOH的PEG活化修饰物；步骤5，利用所述的纯化标签对步骤3所得的融合蛋白产物进行纯化，使目的蛋白与树脂填料结合后，充分洗脱杂蛋白，用切割液buffer3快速浸润填料，立即将柱子两端封口后于4℃反应12～24小时或25℃反应1～4小时，然后用buffer3冲洗柱子并收集流出液，测定样品中蛋白浓度；buffer3的配方为：100mM NaH2PO4，10mM Tris，10‑100mM二硫苏糖醇或2‑巯基乙烷磺酸钠，pH8.0；步骤6，加入50～100倍重组蛋白摩尔量的Cys‑PEG‑COOH修饰物，室温进行连接反应4～6小时，将连接后产物经阴离子交换柱进行纯化，去除没有反应的PEG修饰物；或者，步骤5‑6为：利用所述的纯化标签对步骤3所得的融合蛋白产物进行纯化，使目的蛋白与树脂填料结合后，充分洗脱杂蛋白，用5个柱体积的含有50～100倍重组蛋白摩尔浓度的Cys‑PEG‑COOH修饰物的切割液buffer3快速浸润填料，立即将柱子两端封口后于4℃反应12～24小时或者25℃反应1～4小时，然后用不含Cys‑PEG‑COOH修饰物的buffer3冲洗柱子并收集流出液，经阴离子交换柱进行纯化，去除没有反应的PEG修饰物；步骤7，对PEG修饰的重组蛋白进行纯化。