[发明专利]肝癌磷蛋白组学模型及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及一种肝癌磷蛋白组学模型及其构建方法和应用。通过iTRAQ蛋白标记技术和TiO₂磷酸化肽段富集技术，结合液相串联质谱分析，对肝脏癌变细胞和癌旁组织细胞中的差异蛋白和磷酸化蛋白质进行研究，对差异的磷酸化蛋白的种类、数量、磷酸化位点和功能进行分析，全方位多角度的分析了肝脏癌变组织细胞相对于癌旁组织细胞中差异蛋白和磷酸化蛋白组，该检测结果可以作为诊断原发性肝癌患者的中间结果数据，并为原发性肝癌患者的治疗及发病机理研究提供理论基础和技术支持，并有望成为肝癌病情诊断和监测的重要生物标记物。

主权项

1.一种肝癌磷蛋白组学模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1，分别提取肝脏癌变组织细胞和相应的癌旁组织细胞的总蛋白，得到两组蛋白样本；步骤S2，分别对所述两组蛋白样本进行还原烷基化处理，得到两组蛋白样本溶液；所述步骤S2中，采用四乙基溴化铵对提取的两组蛋白样本的沉淀进行还原烷基化处理，得到相应的蛋白样本溶液；步骤S3，分别向两组蛋白样本溶液中加入胰蛋白酶进行酶解处理，得到两组肽段样本；步骤S4，将每组肽段样本分成两份，得到两份样本，对其中一份的含有肝脏癌变组织细胞的肽段样本和相应的癌旁组织细胞的肽段样本分别使用不同的标记试剂进行iTRAQ标记处理，并将标记处理后的两组肽段样本混合；对其中另一份的含有肝脏癌变组织细胞的肽段样本和相应的癌旁组织细胞的肽段样本分别富集磷酸化的肽段后，再使用不同的标记试剂进行iTRAQ标记处理，并将标记处理后的两组肽段样本混合；步骤S5，分别对两份混合后的样本进行强阳离子交换分离处理；所述步骤S5中，所述强阳离子交换分离处理使用岛津LC‑20AB液相系统，分离柱为4.6×250mm型号的Ultremex SCX柱；步骤S6，分别对强阳离子交换分离处理后的两份样本进行液相色谱分离，再将液相色谱分离得到的肽段进行串联质谱分析；步骤S7，使用蛋白质鉴定软件对质谱分析结果进行蛋白质鉴定，根据蛋白质丰度水平，分析得到肝脏癌变组织细胞和相应的癌旁组织细胞的差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型；所述步骤S7中，所述蛋白质鉴定软件为Mascot，分析过程中，以IPI human v3.87为数据库进行搜索；所述步骤S7中，在根据蛋白质丰度水平进行分析的过程中，当差异倍数达到1.2倍以上，且经统计假定值p‑value小于0.05时，为差异表达蛋白；所述步骤S6中，进行液相色谱分离时使用岛津LC‑20AD型号的纳升液相色谱仪进行标准分离；所述进行串联质谱分析使用串联ESI质谱仪，设置质谱分辨率依次为：一级70000，二级17500，挑选出电荷为2+～5+，峰强度在20000以上的母离子十五个进入二级分析，对肽段使用能量为27+12％的HCD模式进行破碎，碎片在Orbi中检测。