[发明专利]一种研究水稻与病原物互作模式的方法

摘要

本发明公开了一种研究水稻与病原物互作模式的方法，属于植物生物技术领域。本发明综合应用转录组、蛋白质组及miRNA组研究水稻响应病原物侵染的互作模式的方法，其具体步骤包括：A.别取接种病原物前后不同时间点的抗病材料及感病材料的水稻叶片总RNA、Small RNA及总蛋白；B.分别进行差异表达谱分析、差异蛋白质组学分析及miRNA鉴定及其靶基因分析；C.将三种方法鉴定出差异基因、蛋白、miRNA靶基因进行整合、关联以揭示水稻与病原物互作过程中所激活或抑制的抗、感病反应途径，从而可以较为系统的阐明水稻‑稻瘟病菌的互作机制。本发明所述的方法能快速和有效地筛选到与水稻抗病相关联的候选基因。

主权项

1.一种研究水稻与病原物互作模式的方法，其特征在于：综合应用转录组、蛋白质组及miRNA组研究水稻响应病原物侵染的互作模式的方法，其具体步骤包括：A.分别取接种病原物前后不同时间点的抗病材料及感病材料的水稻叶片总RNA、Small RNA及总蛋白；B.分别进行差异表达谱分析、差异蛋白质组学分析及miRNA鉴定及其靶基因分析；C.将三种方法鉴定出差异基因、蛋白、miRNA靶基因进行整合、关联以揭示水稻与病原物互作过程中所激活或抑制的抗、感病反应途径，从而可以较为系统的阐明水稻‑稻瘟病菌的互作机制；步骤B中所述的差异表达谱分析的具体步骤包括：使用NucleoSpin RNA Clean‑up纯化步骤A所得的RNA并进行双链cDNA的合成、纯化；然后体外转录合成生物素标记cRNA，纯化cRNA后进行cRNA的片段化处理；使用Affymetrix杂交仪640将试验材料cRNA与芯片杂交；通过Affymetrix洗涤工作站450进行洗脱、染色；使用Affymetrix基因芯片扫描仪3000扫描芯片，用Affymetrix GeneChip Operating Software Version1.4软件分析芯片杂交图像，把图像信号转化为数字信号，并用dChip软件做校正和标准化处理；每个探针在不同时间点和不同处理间比较以确定差异表达相关基因；步骤B中所述的差异蛋白质组学分析的具体步骤包括：将步骤A所得的蛋白质样品进行进一步FASP酶解、肽段标记、SCX分级及LC‑MS质谱分析，进一步对所得的质谱鉴定结果进行数据查库、定量分析，进行GO聚类分析，选取差异倍数>1.2或<0.8、p值<0.05的蛋白进行进一步分析初步确定差异表达相关蛋白；步骤B中所述的miRNA鉴定及其靶基因分析的具体步骤包括：对步骤A所回收的18‑30nt small RNA与5’衔接子、3’衔接子连接，并进行反转录；反转录产物于Solexa高通量测序仪进行测序，将Solexa测序所得的35nt序列，通过去接头、去低质量、去污染、统计序列长度及分布过程完成初级分析，进一步对初级分析所得到的序列作分类注释，获得样品中包含的各组分及表达量信息；对差异miRNA进行靶基因预测以得到可能调控的靶基因信息，并对靶基因进行Go分类及KEGG通路分析。