[发明专利]豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针

摘要

本申请涉及一种豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法及锁式探针。本申请的检测方法，采用本申请设计的锁式探针同时对豌豆细菌性疫病菌和菜豆晕疫病菌进行滚环扩增，然后结合液相悬浮芯片技术，对两种重要豆类检疫性植物病原细菌进行高通量检测。本申请的检测方法特异性强、灵敏度高，可以缩短豆类检疫性细菌的检测时间，加快我国口岸进出口货物的通关速度，降低企业成本；同时还可以提高进境豆类产品疫情截获率，增强防范外来有害生物入侵的能力，具有重要的技术性和实用性，可产生显著的经济社会效益。

主权项

一种用于豆类检疫性植物病原细菌的高通量检测方法，其特征在于：包括(1)锁式探针环化和扩增：将受检样品的DNA或菌悬液与锁式探针一起进行环化连接反应，用通用引物对连接成环的锁式探针进行滚环扩增；(2)液相芯片检测：将滚环扩增的产物与液相芯片的编码微球杂交，杂交完成后用液相悬浮芯片检测仪进行检测；所述锁式探针包括用于豌豆细菌性疫病菌检测的第一锁式探针和用于菜豆晕疫病菌检测的第二锁式探针，所述第一锁式探针为Seq ID No.1所示序列，所述第二锁式探针为Seq ID No.2所示序列，第一锁式探针和第二锁式探针的5'端都有磷酸化标记；所述液相芯片的编码微球上偶联有与滚环扩增产物杂交的捕获探针；所述捕获探针包括第一捕获探针和第二捕获探针，两条捕获探针分别偶联到不同的编码微球上，所述第一捕获探针用于杂交捕获所述第一锁式探针，所述第二捕获探针用于杂交捕获所述第二锁式探针；所述通用引物为能够与连接成环的锁式探针发生超分支滚环扩增的引物组合，由与锁式探针杂交结合的第一引物和与锁式探针互补序列杂交结合的第二引物组成，其中第一引物的5'端具有生物素标记；Seq ID No.1：5’‑P‑TGTTCAAATACGAAGGCGGTCTGCTCCCAATAGGTCCAGAATGTCAGCCGTTCCTCACACCAGACATGCAGCGTAGGTATCGACTGCAGCGGTAAGGAAGAAT‑3’，Seq ID No.2：5’‑P‑GGTACTCACTTGGTGGGCTTCCGTTTCCCAATAGGTCCAGAATGTCAGCCGTTCCTCACACCAGACGTCACGTATGGTTCGCTGCTCCCACAGCGTGACGGT‑3’；所述第一捕获探针为Seq ID No.3所示序列，所述第二捕获探针为Seq ID No.4所示序列，并且第一捕获探针和第二捕获探针的5'端都分别带有氨基修饰的C12手臂寡核苷酸标记；Seq ID No.3：5’‑ATGCAGCGTAGGTATCGACT‑3’Seq ID No.4：5’‑GTCACGTATGGTTCGCTGCT‑3’；所述第一引物为Seq ID No.5所示序列，所述第二引物为Seq ID No.6所示序列；Seq ID No.5：5’‑GACATTCTGGACCTATTGGGA‑3’；Seq ID No.6：5’‑AGCCGTTCCTCACACCAGAC‑3’。