[发明专利]一种高质量咖啡叶片基因组DNA的高效提取方法

摘要

本发明公开了一种高质量咖啡叶片基因组DNA的高效提取方法，改良了CTAB法，使用PVP粉增强去除酚类、多糖化合物；使用了改良Extraction buffer溶液和Lysis buffer溶液进行植物材料提取和裂解组织细胞；先将氯仿与异戊醇按24∶1(v/v)配置混合液，再与酚等体积混合加入有效去除蛋白质杂质；在沉淀DNA时，采用NaAc(60μL，3M)与冷的无水乙醇(600μL)混合沉淀剂，高速离心，以增加DNA沉淀；用预冷的无水乙醇洗涤DNA沉淀物，去除Na⁺。这种方法能快速高效地分离出高质量咖啡叶片基因组DNA。

主权项

一种高质量咖啡叶片基因组DNA的高效提取方法，其特征在于，包括以下步骤：①取咖啡树枝尖新鲜嫩叶2～3片(约0.2～0.3g)，放入2mL尖底离心管中，盖上盖子，将离心管浸入液氮1～3min后取出用铁丝捣碎。立即加入0.1g PVP粉、0.5mL氯仿(AR)和1mL改良Extraction buffer溶液的混合液，再添加20μL β‑巯基乙醇(2％)后于涡旋振荡仪上摇匀；如果不溶，65℃水浴1h充分溶解。Extraction buffer溶液配方：350mM山梨醇，100mM Tris‑HCl，100mM EDTA pH8.0，0.5％Na₂S₂O₃；②将溶化后的糊状物在离心机上4℃、5000rpm离心10min，吸弃上层液相和下层氯仿。在每管沉淀物中加入600μL Lysis buffer溶液和12μL β‑巯基乙醇(2％)，混匀后放置65℃水浴锅中温浴30min。Lysis buffer溶液配方：0.2M Tris‑HCl pH8，0.05M EDTA，2M NaCl，CTAB 2％；③添加300μL酚及300μL的氯仿：异戊醇混合液，氯仿：异戊醇体积比(v/v)是24∶1，轻轻上下颠倒混匀，形成乳状液后放入离心机4℃、12 000rpm离心15min；④回收上层液相，重复第③步再抽提一次；⑤将上层液相移至一个新的1.5mL尖底离心管，加入60μL 3M NaAc、600μL预冷的无水乙醇(使用前‑20℃冰箱保存)，轻轻上下颠倒混匀后放入离心机4℃、12 000rpm离心15min；⑥吸弃液相，用1mL预冷的无水乙醇洗涤沉淀物2次，弃乙醇；将管倒扣于滤纸上，使乙醇流尽，风干或自然凉干。加入50μL TE缓冲液或ddH₂O溶解沉淀物。TE缓冲液配方：10mMTris‑HCl pH8.0，1mM EDTA pH8.0；⑦电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。