[发明专利]一种在植物中鉴定与蛋白结合的RNA种类和RNA位点的方法

摘要

本发明涉及一种在植物中鉴定与蛋白结合的RNA种类和RNA位点的方法。该方法主要就是通过紫外交联将蛋白与核酸的体内结合状态固定下来，免疫沉淀下来的RNA用核酸酶进行酶切成小片段，然后通过SDS-PAGE和转膜去除非特异性结合的RNA，并利用连接在RNA两端的adaptor进行反转录PCR扩增和大规模测序。该技术有以下几个优点：1)紫外交联是在活体的情况下进行的，因此更能反映体内的真实结合情况；2)由于紫外交联形成的共价键是不可逆的，因此可以用核酸酶消化来缩短与蛋白结合的核酸的长度。随后进行的多步纯化极大地提高了信噪比；3)沉淀后的样品经过SDS-PAGE的分离去除了绝大多数非特异性结合的RNA，而后续的转膜过程去除了游离的RNA；4)RNA的两端分别连上了adaptor，允许后续的PCR扩增和大规模测序。

主权项

一种在植物中鉴定与蛋白结合的RNA种类和RNA位点的方法，其特征在于包括以下步骤：1)紫外交联植物中蛋白质和核酸的相互作用；2)裂解植物细胞和免疫沉淀；3)核酸酶消化；4)3’接头连接和放射性同位素32P标记；5)用SDS‑PAGE分离蛋白‑RNA复合物，并回收相应的片段；6)降解蛋白、分离纯化RNA；7)5’接头连接，TBE‑Urea PAGE凝胶回收RNA片段；8)在RT‑PCR之后，用PAGE凝胶或琼脂糖凝胶电泳回收相应大小条带，该条带为高通量测序文库。