[发明专利]环境水体致TK6细胞染色体损伤遗传毒性检测技术及应用

摘要

本发明提供一种环境水体致TK6细胞染色体损伤遗传毒性检测技术及应用，属于环境科学和健康风险评价领域。所述方法包括环境水体样品的前处理过程、细胞培养及染毒方法、微核制片流程和结果分析方法等。本发明所提供的微核实验方法可直接用于监测环境水体遗传毒性，为水污染健康风险管理提供重要的遗传毒性效应信息。

主权项

1.一种环境水体遗传毒性高通量快速检测方法，所述方法为TK6细胞微核实验方法，包括如下步骤：(1)水样前处理；(2)TK6细胞的复苏与预培养；(3)微核实验步骤；(4)双核细胞及微核的判断标准；其步骤(1)中包含环境水体样品采集之后首先经过0.45μm玻璃纤维滤膜过滤、HLB固相萃取柱富集以及丙酮洗脱、合并，以及干燥的步骤，其中包括按照1L水样定容至10μL浓缩液的比例用DMSO定容样品的步骤；其步骤(3)为：1)细胞铺板：将待传代的TK6细胞按2×105cells/mL铺到24孔板中，使用10％血清的培养基铺板；同时每孔加入终浓度为6μg/mL的细胞松弛素‑B以形成双核细胞；2)细胞染毒：加入一定体积受试物，经实验得出：地下水样品的染毒浓度为0.2‑0.5L水样提取物浓缩液，地表水样品染毒浓度为0.02‑0.05L提取物浓缩液；每孔总体积为1mL，培养24h；3)实验前计数，取1×106个细胞，以125xg，5min离心收集细胞，弃去上清液，加入1mLPBS缓冲液；4)离心弃去上清液，继续加入1mLPBS缓冲液洗涤细胞；5)离心弃去上清液，加入1mL预冷的体积比为甲醇∶冰醋酸＝4∶1的固定液，吹散混匀；6)离心弃去固定液，加入500μL固定液，吹散混匀；7)滴片：将载玻片从冰水中取出，10cm高度滴片，自发干燥；8)染色：用Giemsa染液用pH6.8的PBS按照1∶9的体积比进行稀释，在玻璃染缸中染色13min；9)洗脱：在自来水下轻轻冲洗载玻片15s，注意水流不可太大并且不要直接冲到细胞上，防止将细胞吹落；10)观察微核：使用倒置显微镜，以40×物镜观察细胞或采集图像；11)计数微核千分率，和污染指数。